采用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）生產(chǎn)重組蛋白過(guò)程中的乳酸積累是常見(jiàn)的現(xiàn)象，通過(guò)乳酸代謝可以窺探出細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的綜合狀況。
本文綜述上游工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中的乳酸積累原因與問(wèn)題解決方案，同時(shí)根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中乳酸檢測(cè)結(jié)果提出新的觀點(diǎn)。
葡萄糖代謝在細(xì)胞生長(zhǎng)、目標(biāo)蛋白表達(dá)過(guò)程中具有十分重要的地位。
圖2：典型的Fed-batch細(xì)胞生長(zhǎng)和乳酸代謝趨勢(shì)圖
如圖3，F(xiàn)ed-batch培養(yǎng)中當(dāng)細(xì)胞密度第4天達(dá)到峰值開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，乳酸達(dá)到2.5 g/L后開(kāi)始下降，而后培養(yǎng)第6天開(kāi)始，細(xì)胞乳酸并不繼續(xù)消耗，培養(yǎng)第10天后，乳酸快速增加，最后達(dá)到3.3 g/L。綜合其它參數(shù)如細(xì)胞活率下降較快，頻繁補(bǔ)堿，且此批次最后產(chǎn)量明顯下降看出此批次乳酸代謝為異常代謝。
圖4：乳酸異常代謝發(fā)生后典型的細(xì)胞液變化
細(xì)胞株的影響
現(xiàn)今廣泛使用的基因隨機(jī)插入CHO宿主細(xì)胞，導(dǎo)致宿主細(xì)胞原有的代謝體系發(fā)生改變，轉(zhuǎn)染后篩選的不同克隆之間細(xì)胞代謝特性可能有較大差異，這導(dǎo)致在不同克隆中出現(xiàn)不同的乳酸代謝速率。
細(xì)胞在傳質(zhì)不足時(shí)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足、細(xì)胞微環(huán)境溶氧不足，從而導(dǎo)致糖代謝不完全，造成乳酸積累，如在50ml轉(zhuǎn)管、搖瓶中培養(yǎng)中細(xì)胞液裝量過(guò)大、搖床轉(zhuǎn)速不足，在生物反應(yīng)器中攪拌槳過(guò)小、攪拌轉(zhuǎn)速不足。
葡萄糖作為糖代謝的底物，增加底物濃度促進(jìn)糖代謝，在細(xì)胞難以消耗更多能量情況下出現(xiàn)乳酸積累造成pH下降。
谷氨酰胺同樣可通過(guò)代謝路徑進(jìn)入糖代謝，過(guò)量谷氨酰胺進(jìn)入培養(yǎng)基體系造成乳酸嚴(yán)重積累。
銅離子是乳酸代謝及細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵，當(dāng)培養(yǎng)基銅離子不足且消耗殆盡，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)乳酸異常代謝特征。
高二氧化碳累積造成線粒體功能下降，導(dǎo)致細(xì)胞需要通過(guò)乳酸生成路徑獲得補(bǔ)充能量，此種情況時(shí)常發(fā)生在大型生物反應(yīng)器中。
乳酸對(duì)于細(xì)胞并不是有毒成份或副產(chǎn)物，相反乳酸是細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物，在一些案例中培養(yǎng)基中添加乳酸可以降低銨離子積累和提高產(chǎn)量。
乳酸是細(xì)胞代謝的特征產(chǎn)物，常被用于檢測(cè)細(xì)胞代謝狀況，細(xì)胞代謝過(guò)程中除了乳酸外有如蘋果酸、延胡索酸、檸檬酸等中間代謝產(chǎn)物，在一些案例中，乳酸并沒(méi)有積累，細(xì)胞pH同樣失控持續(xù)下降導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)早凋亡。乳酸異常代謝過(guò)程的評(píng)判需要進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞液pH變化，異常的乳酸代謝通常伴隨pH下降。在一些案例中如圖5，乳酸雖然累積且沒(méi)有下降，但細(xì)胞液pH持續(xù)上升，蛋白表達(dá)和pH控制良好。
圖5：可能認(rèn)為乳酸異常代謝的案例
參考文獻(xiàn)
Fiona Hartley, Tracy Walker, Vicky Chung, Karl Morten. Mechanisms driving the lactate switch in Chinese hamster ovary cells[J]. Biotechnology and Bioengineering. 2018 Aug;115(8):1890-1903
Jamey D Young. Metabolic flux rewiring in mammalian cell cultures[J]. Current Opinion in Biotechnology. 2013 Dec;24(6):1108-15
Brunner M, Doppler P, Klein T, Herwig C, Fricke J. Elevated pCO2 affects the lactate metabolic shift in CHO cell culture processes[J]. Eng Life Sci. 2017 Dec 19;18(3):204-214
Li J, Wong CL, Vijayasankaran N, Hudson T, Amanullah A. Feeding lactate for CHO cell culture processes: impact on culture metabolism and performance[J]. Biotechnol Bioeng. 2012 May;109(5):1173-86
Zagari F, Jordan M, Stettler M, Broly H, Wurm FM. Lactate metabolism shift in CHO cell culture: the role of mitochondrial oxidative activity[J]. N Biotechnol. 2013 Jan 25;30(2):238-45
