通過離子交換層析清除病毒，可以提高治療性蛋白產(chǎn)品的安全性。病毒清除的穩(wěn)健性，取決于病毒與帶相反電荷的層析介質(zhì)之間的靜電結(jié)合。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒異嗜性小鼠白血病病毒（XMuLV），即使在病毒和介質(zhì)都帶正電荷的情況下，其與介質(zhì)之間的結(jié)合依然是穩(wěn)健的。
該文獻(xiàn)通過比較XMuLV和細(xì)小病毒的病毒-介質(zhì)結(jié)合行為，來研究這種與正常預(yù)期相反的現(xiàn)象，這兩類病毒在大小和結(jié)構(gòu)上有很大差異，但是兩者的等電點(diǎn)是相似的。當(dāng)兩類病毒都帶負(fù)電時(shí)，XMuLV與帶正電的陰離子交換介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度高于細(xì)小病毒。當(dāng)兩類病毒都帶正電的時(shí)候，XMuLV與帶正電的介質(zhì)緊密結(jié)合，但是細(xì)小病毒是游離的。這些發(fā)現(xiàn)表明，XMuLV與填料的結(jié)合增強(qiáng)是通過局部電荷分布來實(shí)現(xiàn)的，細(xì)小病毒不具備這種特性，這種特性是設(shè)計(jì)層析工藝清除病毒穩(wěn)健性能力的重要考量。
治療性蛋白的生產(chǎn)通常采用陰離子流穿（FT-AEX）層析和陽離子結(jié)合洗脫（BE-CEX）層析純化步驟。這些步驟主要是基于和層析介質(zhì)之間不同靜電相互作用的強(qiáng)度從產(chǎn)物中去除雜質(zhì)和病毒。理論上，病毒-介質(zhì)的相互作用會(huì)受到病毒等電點(diǎn)（pI）、溶液pH、溶液離子強(qiáng)度（離子濃度）、病毒上可結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量以及競爭分子等因素影響。目前報(bào)道的研究，證明了一些病毒清除的溶液影響因素，但是對(duì)病毒結(jié)構(gòu)的影響知之甚少。
美國和歐洲的監(jiān)管機(jī)構(gòu)分析了申請(qǐng)者提交的病毒清除研究，觀察到離子交換層析步驟具有顯著的病毒清除潛力。大量的數(shù)據(jù)證實(shí)，在通常情況下使用強(qiáng)陰離子交換或弱陰離子交換層析，可以獲得穩(wěn)健的逆轉(zhuǎn)錄病毒清除效果，尤其是在上樣pH足夠高的條件下。對(duì)于BE-CEX，也有一致的逆轉(zhuǎn)錄病毒清除效果的報(bào)道。然而，目前還不清楚為什么小的、無包膜的細(xì)小病毒比大的、有包膜的逆轉(zhuǎn)錄病毒清除更不穩(wěn)定且效果更差；為什么在pH 5的條件下，XMuLV和層析介質(zhì)都帶正電荷，XMuLV仍能與層析介質(zhì)結(jié)合。因此在相同條件下比較有包膜的XMuLV與無包膜的細(xì)小病毒的病毒-介質(zhì)結(jié)合方式，可能會(huì)得到新的啟示。
本研究頭對(duì)頭分析了相同條件下不同模型病毒在FT-AEX和BE-CEX步驟的大量病毒清除數(shù)據(jù)。通過這些數(shù)據(jù)從病毒結(jié)構(gòu)特征以及多角度的影響，揭示了電荷相互作用的機(jī)制，包括檢測在不同上樣pH、電導(dǎo)以及使用更高等電點(diǎn)的模型病毒條件下病毒的清除效果。除了靜電相互作用外，該發(fā)現(xiàn)對(duì)病毒的結(jié)構(gòu)特征引起的病毒與介質(zhì)結(jié)合強(qiáng)度的差異進(jìn)行了定性解釋。
? 生產(chǎn)過程
本研究分析了60多個(gè)離子交換層析的病毒清除研究數(shù)據(jù)，以更好地了解驅(qū)動(dòng)病毒清除的機(jī)制，并確定有利于穩(wěn)健清除病毒的條件。簡而言之，利用離心或深層過濾收集細(xì)胞培養(yǎng)料液，進(jìn)行第一步親和捕獲層析。然后用低pH處理親和產(chǎn)物來滅活包膜病毒。隨后，采用經(jīng)典的精純純化步驟進(jìn)一步純化蛋白，包括一步FT-AEX（精純1）和一步BE-CEX（精純2）。在某些情況下，F(xiàn)T-AEX作為精純2步驟。最后進(jìn)行病毒過濾、超濾置換及輔料添加制備原液。精純1的產(chǎn)物中HCP殘留是200 ng/mg，或者小于200 ppm，并且宿主細(xì)胞DNA低于檢測限（<0.1 pg/mg）。與精純2對(duì)比，精純1的上樣料液含有更多雜質(zhì)，其HCP殘留是精純2上樣料液的十倍以上。
? 縮小模型
使用縮小模型模擬生產(chǎn)條件進(jìn)行病毒清除研究?？s小模型的關(guān)鍵參數(shù)是層析介質(zhì)類型（填料或者膜）、柱高、起始料液的成分、流速、溶液成分（包括pH和電導(dǎo)）、溶液體積、溫度、載量和產(chǎn)物收集標(biāo)準(zhǔn)。在多數(shù)情況下，基于層析特征、收率和產(chǎn)品質(zhì)量來證明縮小模型的有效性。分析檢測結(jié)果證明了產(chǎn)物質(zhì)量與大規(guī)模生產(chǎn)的質(zhì)量相當(dāng)。檢測方法包括：A280 nm法檢測總蛋白、酶聯(lián)免疫法檢測HCP、PCR法檢測宿主細(xì)胞DNA、體積排阻色譜檢測純度（用單體和聚體的百分比來表示）。病毒spiking實(shí)驗(yàn)和鑒定試驗(yàn)使用相同的起始料液、層析柱和操作參數(shù)。三種陰離子填料和一種膜介質(zhì)具有強(qiáng)陰離子交換劑的季胺基基團(tuán)，一種陰離子填料具有強(qiáng)陰離子交換劑的聚乙烯亞氨基基團(tuán)。陽離子填料具有強(qiáng)陽離子交換劑的硫丙基基團(tuán)。
? 模型病毒和病毒測定
使用的六個(gè)模型病毒如表1所示，包括有包膜的異嗜性小鼠白血病病毒（XMuLV）、假狂犬病毒（PRV）和無包膜的病毒呼腸孤病毒3型（Reo3）、猿猴病毒40（SV40）、豬細(xì)小病毒（PPV）和小鼠細(xì)小病毒（MVM）。目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道PPV的pI。MVM和PPV這兩個(gè)病毒在離子交換層析實(shí)驗(yàn)中，沒有表現(xiàn)出明顯的差異，在遺傳上密切相關(guān)，具有相似的二十面體衣殼組裝和大小，49%的蛋白質(zhì)具有同源性，即使表面電荷分布略有不同，相比于XMuLV，他們之間的總體差異很小。為了方便與XMuLV進(jìn)行比較，本研究將MVM和PPV的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為細(xì)小病毒類別進(jìn)行綜合分析，并在圖中用不同的符號(hào)進(jìn)行說明。實(shí)驗(yàn)中使用高純度的病毒懸液，添加量通常是7-9 log10，添加比例≤1%。
采用空斑測試或半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量（TCID50）測定病毒清除研究中樣品的病毒滴度。在空斑測試中，接種指示細(xì)胞并培養(yǎng)至合適的密度。對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋、接種和孵育促使病毒復(fù)制。孵育結(jié)束后先計(jì)算空斑數(shù)，然后基于空斑數(shù)和起始樣品體積計(jì)算病毒效價(jià)（pfu/mL）。在TCID50測試中，接種指示細(xì)胞至96孔板并培養(yǎng)至合適的密度。對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋、接種和孵育促使病毒復(fù)制。孵育結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞病變效應(yīng)分析，并采用Spearman-Karber法計(jì)算病毒滴度(TCID50/mL)。所有實(shí)驗(yàn)均包括檢測病毒的陰性和陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
此外，在病毒清除研究之前，對(duì)樣品進(jìn)行指示細(xì)胞的毒性測試和讀數(shù)干擾測試，若發(fā)現(xiàn)樣品濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，則對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂寔頊p小這些影響。在實(shí)驗(yàn)期間，將添加病毒后的上樣樣品保存在工藝溫度下，作為病毒穩(wěn)定性的對(duì)照，若其滴度低于上樣樣品，則用于計(jì)算log10降低值（LRV）。選擇性地檢測流穿、清洗和高鹽Strip樣品中的病毒分布情況，以更好地研究病毒清除機(jī)制。
? 病毒清除實(shí)驗(yàn)
病毒清除實(shí)驗(yàn)通過將測試病毒注入原始料液，經(jīng)精純步驟后，比較每個(gè)步驟前后的病毒數(shù)量來確定LRV。所有實(shí)驗(yàn)都是重復(fù)進(jìn)行的，使用平均LRV進(jìn)行分析，包括使用新、舊填料重復(fù)實(shí)驗(yàn)的情況。新、舊填料的LRV差異都小于1.0 log10。只有在其他重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間的差異超過1.0 log10情況下，采用較低的LRV。
? 上樣pH對(duì)FT-AEX層析清除病毒的影響
FT-AEX模式下，帶正電的層析介質(zhì)捕獲帶負(fù)電的雜質(zhì)和假定的病毒，同時(shí)帶正電的蛋白產(chǎn)品流穿。對(duì)于FT-AEX，評(píng)估了具有季胺基團(tuán)或聚乙烯亞胺基團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換樹脂，上樣pH在5.3~8.2范圍內(nèi)，電導(dǎo)率< 11 mS/cm。產(chǎn)品pI > 7，在該實(shí)驗(yàn)條件下蛋白帶正電。
XMuLV在上樣pH 6.3~8.2范圍內(nèi)，平均LRV為5.9（n=24），其中16個(gè)實(shí)驗(yàn)組的病毒清除效果達(dá)到了檢測限，只有1組LRV低于4（圖1A，左）。在相同的pH范圍內(nèi)，細(xì)小病毒清除效果差異較大，平均LRV為5.2（n=24），其中18個(gè)實(shí)驗(yàn)組病毒LRV > 4.0（圖1A，中），另外6組細(xì)小病毒LRV < 4.0，所有樣品均來自精純1工藝步驟（圖1A，虛線框），表明早期步驟中的雜質(zhì)可能與病毒競爭結(jié)合。此外，在相同條件下，細(xì)小病毒清除受溶液電導(dǎo)率的影響較大，而XMuLV清除受到其影響較?。▓D1C）。
當(dāng)上樣pH降低至5.3~6.1時(shí)，不管是低于或者接近病毒pI（XMuLV pI=5.8，假設(shè)PPV pI接近6.2），XMuLV的平均LRV為6.3，PPV的平均LRV僅有1.7（圖1A，右）。對(duì)pI為7的單抗案例進(jìn)行深入分析，將上樣pH從5.3提高至6.4，PPV清除可以從LRV 1.9提高至LRV 5.9（圖1D）。精純2步驟的上樣pH為5.3，初始料液的HCP < 5 ng/mg。精純1步驟的上樣pH為6.4，初始料液的HCP約為200 ng/mg。由于上樣pH 6.4情況下LRV更高，這說明HCP的競爭結(jié)合不是這組數(shù)據(jù)的關(guān)鍵因素。一種可能的解釋是，凈正電荷阻止細(xì)小病毒與AEX介質(zhì)結(jié)合，而凈正電荷不足以阻止XMuLV與AEX介質(zhì)結(jié)合。
? 膜層析FT-AEX清除病毒
當(dāng)上樣pH低于產(chǎn)品pI時(shí)，膜層析FT-AEX的季胺基基團(tuán)清除病毒的趨勢(shì)（圖2）與層析柱FT-AEX相似（圖1A）。上樣pH在6.9和7.4以及5.0~6.3范圍內(nèi)，XMuLV清除都較為穩(wěn)健（圖2）。上樣pH為6.9和7.4時(shí)，細(xì)小病毒的平均LRV是3.9（n=2）。上樣pH在 5.0~6.3范圍內(nèi)，上樣pH低于或接近病毒pI，細(xì)小病毒的清除效果較差。（圖2，右，n=9，5 PPVS，4 MVMS）。
LRV多樣性變化有多種潛在的原因，包括雜質(zhì)或者產(chǎn)品的競爭以及加入病毒的純度和質(zhì)量。然而，這組數(shù)據(jù)來自精純2步驟，其初始料液具有低HCP和低于檢測限的DNA，除了A組中的一個(gè)案例來自精純1步驟（在圖2中用菱形符號(hào)表示）具有高LRV。產(chǎn)品帶有正電荷，并且膜層析對(duì)這兩種病毒具有相同的作用。這些結(jié)果和考量因素共同表明，病毒的電荷狀態(tài)是結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力，XMuLV結(jié)合可能涉及更多的復(fù)雜性。
膜層析FT-AEX的LRV（圖2）比層析柱（圖1A）略低。但在特定的上樣pH范圍內(nèi)比較，LRV趨勢(shì)相似：高LRV的上樣pH接近中性，低LRV的上樣pH在5.0~6.3范圍內(nèi)。在蛋白不超載的情況下，三種病毒進(jìn)行膜吸附和層析柱FT-AEX中觀察到類似的LRV趨勢(shì)。膜層析的蛋白結(jié)合超載，尤其是高雜質(zhì)料液，可能導(dǎo)致細(xì)小病毒競爭加劇。在所有的案例中，XMuLV結(jié)合沒有受到明顯的影響，除非在本研究中上樣pH明顯高于產(chǎn)品pI（見下文）。
? 產(chǎn)物凈電荷對(duì)膜層析FT-AEX清楚XMuLV的影響
有些情況下用FT-AEX純化帶負(fù)電荷的蛋白產(chǎn)物，尤其是低pI的蛋白。膜層析FT-AEX的結(jié)果表明，帶負(fù)電荷的蛋白產(chǎn)物不利于清除XMuLV（圖3，左，開放圓圈），可能是由于產(chǎn)物和病毒競爭結(jié)合位點(diǎn)。這與蛋白產(chǎn)物帶正電荷時(shí)，具有較高LRV（多數(shù)> 4.0）形成反差（圖3，右）。
? BE-CEX
在BE-CEX模式下，帶正電荷的雜質(zhì)、假設(shè)的病毒和蛋白產(chǎn)物結(jié)合到層析介質(zhì)，同時(shí)帶負(fù)電荷的的雜質(zhì)流穿。然后產(chǎn)物在合適的鹽濃度下被洗脫，在這個(gè)條件下雜質(zhì)和病毒仍然結(jié)合在介質(zhì)上。本研究中上樣pH多在4.5~7.0范圍內(nèi)，接近5.0，但是所有的情況上樣pH均低于蛋白pI，因此產(chǎn)品攜帶正電荷。
? 病毒類型對(duì)BE-CEX病毒清除的影響
BE-CEX的結(jié)果表明，XMuLV去除效果（n=24）是多變的，無細(xì)小病毒去除（n=7）效果（圖4A）。7組案例中，其中3組XMuLV的LRV＞4.0，剩余4組LRV＜2.0.。在XMuLV穩(wěn)健清除的案例中，病毒與填料緊密結(jié)合但未失活，其感染性可在高鹽Stirp收集產(chǎn)物中恢復(fù)（圖4B）。
? BE-CEX工藝條件對(duì)XMuLV清除的影響
可以根據(jù)上樣pH、洗脫pH以及洗脫緩沖液的鹽濃度對(duì)XMuLV清除效果進(jìn)一步分組（圖5）。上樣pH約為5時(shí)，洗脫前清洗或者不清洗，使用中等鹽濃度進(jìn)行洗脫，可有效地實(shí)現(xiàn)XMuLV的穩(wěn)健清除（圖5A, n = 16）。pH 5.0下用較高的鹽濃度洗脫時(shí)（n = 2），或在較高的pH（5.9-8.5）洗脫時(shí)（n = 6），XMuLV與產(chǎn)物會(huì)共洗脫，病毒清除效果顯著降低（圖5B）。XMuLV的清除依賴于洗脫pH和鹽濃度，表明凈電荷相互作用仍然是驅(qū)動(dòng)病毒結(jié)合的關(guān)鍵動(dòng)力，但這并不能解釋細(xì)小病毒無法這樣結(jié)合的原因。這些結(jié)果與之前BE-CEX的病毒清除結(jié)果基本一致。
? 病毒等電點(diǎn)對(duì)BE-CEX病毒清除效果的影響
如果靜電相互作用是驅(qū)動(dòng)病毒去除的關(guān)鍵因素，則可以預(yù)測在高洗脫pH條件下，BE-CEX能有效去除較高pI的病毒。PRV就是這樣，它的pI是7.6。在pH 5.9-8.5的洗脫條件下，XMuLV、細(xì)小病毒、Reo 3和SV40的LRV均小于2.0，但PRV的LRV大于5.0（圖6）。感染性檢測表明，PRV與填料結(jié)合緊密，在產(chǎn)物環(huán)境中未被滅活（數(shù)據(jù)未顯示）。
使用96孔高通量方式篩選最佳AEX參數(shù)時(shí)，觀察到XMuLV在pH5時(shí)與AEX介質(zhì)的結(jié)合與正常預(yù)期相反。本研究提供了全面的病毒清除數(shù)據(jù)，證實(shí)攜帶凈正電的XMuLV確實(shí)可以與帶正電的AEX介質(zhì)高強(qiáng)度結(jié)合（圖1和圖2）。
使用粗粒度模型結(jié)合單個(gè)氨基酸突變體研究了帶電表面的蛋白結(jié)合。結(jié)果表明，局部電荷或微環(huán)境區(qū)域?qū)Y(jié)合比整體蛋白凈電荷更重要。正如最近使用結(jié)構(gòu)照明顯微鏡和計(jì)算平均值所觀察到的，病毒膜上的蛋白質(zhì)是可移動(dòng)的，并且能夠形成功能簇。這些觀察結(jié)果共同支持以下假設(shè)：XMuLV表面帶負(fù)電荷的、局部的、潛在的可移動(dòng)的蛋白可能是XMuLV與陽性AEX介質(zhì)結(jié)合的原因。細(xì)小病毒沒有膜，因此不具有這種特性。
XMuLV表面的糖基化蛋白可能發(fā)揮作用，在未來的研究中可以檢測去糖基化的XMuLV結(jié)合模式。XMuLV的脂質(zhì)膜形狀多變、尺寸較大以及局部電荷分布都可能有助于通過長距離增強(qiáng)結(jié)合強(qiáng)度。相反，細(xì)小病毒體積較小、形狀固定、沒有脂質(zhì)膜、沒有糖基化蛋白，表明在電荷相互作用的背景下，細(xì)小病毒表現(xiàn)得與傳統(tǒng)蛋白更為相似（圖7）。
基于本研究的綜合分析，在相同的FT-AEX條件下，相對(duì)于XMuLV，細(xì)小病毒展現(xiàn)出與層析介質(zhì)更弱的結(jié)合能力。pI略高的細(xì)小病毒可能也有利于弱結(jié)合。比如，BE-CEX層析在上樣pH5時(shí)，攜帶較少正電的XMuLV（pI~5.8）仍然能與CEX介質(zhì)有較高的結(jié)合強(qiáng)度，在高鹽狀態(tài)下洗脫，與產(chǎn)品分離（圖4B）。在相同的條件下，細(xì)小病毒攜帶更多的正電（pI~6.2）仍不能有效結(jié)合，因?yàn)樗诹鞔┎糠趾拖疵摦a(chǎn)物部分被回收（數(shù)據(jù)未展示）。這些觀察結(jié)果更能表明細(xì)小病毒的弱結(jié)合強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)有關(guān)，與凈電荷無關(guān)。
在Protein A層析研究中，發(fā)現(xiàn)XMuLV與單抗體共結(jié)合和共洗脫，LRV一般在1~4 logs之間。相反，F(xiàn)T-AEX對(duì)XMuLV可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健地清除，LRV高于4 logs。這表明病毒與產(chǎn)物共結(jié)合并與產(chǎn)物共洗脫，會(huì)造成更低的病毒清除效果。
表2總結(jié)了在本研究中穩(wěn)健清除病毒的情況。與細(xì)小病毒相比，XMuLV表現(xiàn)出與層析介質(zhì)更強(qiáng)的結(jié)合能力，更有利于病毒的穩(wěn)健清除。XMuLV更大的外形和局部結(jié)構(gòu)可以增加多樣性的相互作用，類似于抗原-抗體相互作用的親和作用概念。由于病毒-介質(zhì)結(jié)合發(fā)生十分迅速，在結(jié)合能力限度內(nèi)，相對(duì)于病毒結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)，流速/保留時(shí)間和柱高等工藝參數(shù)對(duì)病毒清除的影響非常小。因此可以簡化離子交換層析對(duì)病毒清除穩(wěn)健性的預(yù)測。
XMuLV與填料結(jié)合強(qiáng)度很大，這也是因?yàn)?，與細(xì)小病毒相比，XMuLV的清除幾乎不受層析過程中雜質(zhì)競爭的影響（比如，精純1步驟的起始料液中存在酸性HCP）（圖1A）。只有當(dāng)病毒和產(chǎn)物具有相同的電荷狀態(tài)時(shí)，XMuLV清除才會(huì)受到影響（圖3），這種情況下，產(chǎn)物的數(shù)量可能超過雜質(zhì)數(shù)量的幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持FT-AEX在上樣pH7.0-8.5，電導(dǎo)率< 14 mS/cm時(shí)，平均LRV> 5.0。這些條件也適用于基于膜的FT-AEX層析（圖2）。XMuLV在相同條件下，如果料液中存在少量競爭雜質(zhì)，細(xì)小病毒也可以實(shí)現(xiàn)平均LRV> 5.0（圖1A，中）。
在相同的條件下，BE-CEX可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的XMuLV清除效果，平均LRV> 4.0（圖5）。另外，研究結(jié)果表明BE-CEX可以與FT-AEX互補(bǔ)清除病毒。比如，pI為8的細(xì)小病毒在上樣pH接近7的情況下不能清除，但是通過BE-CEX可能會(huì)被清除（圖6）。
離子交換層析對(duì)病毒的清除依賴于靜電相互作用，但是病毒結(jié)構(gòu)和大小會(huì)影響相互作用強(qiáng)度，影響工藝的穩(wěn)健性。本研究證明FT-AEX、BE-CEX的單步層析或者兩步聯(lián)用，在特定的上樣pH和電導(dǎo)率條件下，多種病毒可以被穩(wěn)健地清除。
通過本研究可以識(shí)別并避免病毒清除能力降低的具體條件，從而在實(shí)踐中采用上樣pH在7.0~8.5范圍內(nèi)，電導(dǎo)率小于14 mS/cm的方法進(jìn)行產(chǎn)品病毒安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，而不是傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)評(píng)估。從而也能夠節(jié)省資源，用于實(shí)施綜合策略，以最大限度地減少整體病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。
