生物制品作為現(xiàn)代醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分，對(duì)于治療疾病和保障公共健康發(fā)揮著重要作用。近幾年生物制品行業(yè)蓬勃發(fā)展，生物制品的種類很多，常見的有疫苗、血液制品、抗體藥物、重組蛋白等等，還有以PD-1、PD-L1為代表的免疫檢查抑制劑和以CAR-T為代表的細(xì)胞治療已經(jīng)成為火熱的研究領(lǐng)域，隨著新冠疫情的爆發(fā)，同時(shí)也衍生了一大波疫苗的研發(fā)浪潮。

然而，在生物制品的生產(chǎn)過程中，各國藥審部門對(duì)于生物藥品中熱原物質(zhì)的含量都有嚴(yán)格控制要求，因?yàn)闊嵩吹拇嬖跁?huì)對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性產(chǎn)生巨大的影響，生產(chǎn)過程中，即使微小的細(xì)菌污染也可能引入內(nèi)毒素，即便起始樣品本身不含內(nèi)毒素也可能由環(huán)境或操作過程受到熱原污染，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)品安全，而較主要的熱原就是內(nèi)毒素(Endotoxin）。所以在生物制品的生產(chǎn)過程中，采取有效的內(nèi)毒素控制策略是非常重要的。

對(duì)于酵母表達(dá)系統(tǒng)或CHO （中國倉鼠卵巢細(xì)胞系）系統(tǒng)等，雖然表達(dá)系統(tǒng)本身不產(chǎn)生內(nèi)毒素，但在生產(chǎn)過程中因原、輔材料，生產(chǎn)環(huán)境以及個(gè)人操作等因素造成產(chǎn)品內(nèi)毒素污染，這是產(chǎn)生內(nèi)毒素的主要來源。

要從生物產(chǎn)品中去除內(nèi)毒素，首先需要進(jìn)一步了解內(nèi)毒素的性質(zhì)。內(nèi)毒素是指具有相關(guān)毒性的細(xì)菌細(xì)胞成分。具體來說高純度內(nèi)毒素屬脂多糖類(Lipopolysaccharide簡(jiǎn)稱 LPS)，來源于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜，是細(xì)菌死亡或分解后被釋放出來的（圖1）。其成分主要含三個(gè)不同的化學(xué)區(qū)：包括內(nèi)層的類脂 A 區(qū)（Lipid A）——引起熱原反應(yīng)、核心多糖區(qū)（Core polysaccharide）和特異性多糖鏈區(qū)（repeating oligosaccharides）（圖2）。由于內(nèi)層和中層含許多磷酸基和酸基，所以內(nèi)毒素帶負(fù)電荷。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素一端的特異性多糖區(qū)是親水性質(zhì)的，而另一端的類脂 A 區(qū)則是疏水性質(zhì)的，結(jié)構(gòu)上類似表面活性劑，所以也是具有一定的疏水性質(zhì)。內(nèi)毒素一般以聚體形式存在，在親水環(huán)境中還可形成雙層脂膜或脂囊。內(nèi)毒素的磷酸基團(tuán)和二價(jià)金屬離子螯合，可進(jìn)一步穩(wěn)定內(nèi)毒素分子間的聚合，促成更大的內(nèi)毒素復(fù)合體，所以分子量可由幾千至數(shù)千萬不等。所以根據(jù)內(nèi)毒素分子具有帶負(fù)電荷和疏水性特點(diǎn)，使其可以結(jié)合帶正電荷和疏水性的分子。

內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì)，因此非常耐熱。在100 ℃的高溫下加熱1小時(shí)也不會(huì)被破壞，只有在160 ℃的溫度下加熱2-4個(gè)小時(shí)，或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30分鐘以上才能破壞它的生物活性。

內(nèi)毒素是生物制品中最主要的熱原污染，目的樣品中極微量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入人體就會(huì)引起高熱、腹瀉、血管擴(kuò)張，甚至昏厥或死亡。由于內(nèi)毒素顯著的危害性，F(xiàn)DA等法規(guī)也對(duì)內(nèi)毒素控制和將其降低到安全水平提出明確要求。

圖1  轉(zhuǎn)載自BioRender.com(2021)的“外毒素與內(nèi)毒素”。

從檢索 https://app.biorender.com/biorender-templates．

圖2  轉(zhuǎn)載自BioRender.com(2021)的“革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)”。

從檢索 https://app.biorender.com/biorender-templates．

革蘭氏陰性菌的包膜由內(nèi)膜、質(zhì)周肽聚糖層和外膜組成。內(nèi)毒素脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌外膜外葉的主要成分(Sampath 2018)。

因生物制品和傳統(tǒng)藥物有很大不同，生產(chǎn)過程中對(duì)微生物的控制策略也不同。為了綜合控制生產(chǎn)過程中的內(nèi)毒素，需要在不同階段采取相應(yīng)的控制策略。

? 原材料的嚴(yán)格篩選和管理

? 生產(chǎn)環(huán)境的管理和清潔措施

? 生物過程的優(yōu)化和監(jiān)測(cè)

? 細(xì)胞系的選擇和工程

? 純化和分離工藝的優(yōu)化

? 最終產(chǎn)品的測(cè)試和驗(yàn)證

? 系統(tǒng)性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理

內(nèi)毒素控制是生物制品生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。通過原材料的嚴(yán)格篩選、生產(chǎn)環(huán)境的管理、生物過程的優(yōu)化、細(xì)胞系的選擇和工程、純化工藝的優(yōu)化以及最終產(chǎn)品的測(cè)試和驗(yàn)證，可以綜合控制內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)。