培養(yǎng)溫度的改變會影響到細胞內(nèi)一系列與蛋白質(zhì)合成和分泌相關(guān)的基因表達水平。這種影響很大程度上取決于最終降溫溫度和降溫時間。目前降溫工藝在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞生產(chǎn)蛋白的工藝中被頻繁采用，目的是提高產(chǎn)量，控制質(zhì)量屬性。
在本研究中，根據(jù)抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量屬性以及細胞本身的生長情況評估降溫工藝對兩種CHO GS K1細胞株產(chǎn)生的影響。研究表明合適的降溫工藝對細胞株A單克隆抗體mAb1表達具有顯著提升并且工藝可放大到5 L、1,000 L規(guī)模，最終mAb1滴度相比未降溫的對照組提高了25%。在細胞株B對抗體mAb2的表達中，降溫工藝并未引起最終產(chǎn)量的顯著提高。除了影響蛋白產(chǎn)量，研究發(fā)現(xiàn)降溫工藝對包括電荷異質(zhì)性，N糖基化和分子大小變異體在內(nèi)的蛋白質(zhì)量屬性有顯著影響。
▇▇ 通過搖瓶與2 L反應(yīng)器實驗確定細胞株A的最佳降溫工藝
為確定降溫對mAb1產(chǎn)量的影響，在搖瓶實驗中，設(shè)置了32℃，33.5℃和35℃三種常見的降溫水平。降溫時間分別在3、6、9天進行，以貫穿生產(chǎn)過程中細胞不同的生長階段，包括早期指數(shù)生長階段，細胞密度峰值階段和晚期生產(chǎn)階段。實驗表明，與37℃培養(yǎng)的對照組相比，溫度在第6天降至32℃的實驗組的mAb1滴度從1.20提高至1.31（圖1a；p＜0.0001）。在第3和第6天降溫至32℃的實驗組的10-14天單位蛋白產(chǎn)率（圖1b）顯著高于未降溫的對照組（分別是1.29和1.33）。在生產(chǎn)晚期第9天降溫的實驗組無論是滴度還是產(chǎn)率都沒有明顯變化，而在較早天數(shù)（Day3和Day6）進行的小幅度的降溫（33.5℃和35℃）會導(dǎo)致滴度和產(chǎn)率的降低（p＜0.0001）。由于搖瓶實驗中最高產(chǎn)率出現(xiàn)在設(shè)計實驗的邊界點，所以2 L反應(yīng)器中的溫度設(shè)置以32℃為中心進行小幅度轉(zhuǎn)換，降溫時間設(shè)置在第3,、4、5、6天。實驗證實了在第5天將溫度降至32℃會得到最高的抗體滴度（圖1c）。在所有轉(zhuǎn)換天數(shù)中，30.5℃和32℃的產(chǎn)率均高于未降溫對照組（圖1d）且32℃的最終滴度最高。
圖1 溫度轉(zhuǎn)換下?lián)u瓶蛋白滴度（a）和單位產(chǎn)率（b）以及2L反應(yīng)器中蛋白滴度（c）和單位產(chǎn)率（d）
▇▇ 降溫工藝對細胞株A蛋白質(zhì)質(zhì)量屬性的影響
取樣搖瓶和2 L反應(yīng)器后期樣品檢測電荷異質(zhì)性，N糖基化和分子大小變異體。發(fā)現(xiàn)降溫工藝對蛋白質(zhì)量屬性的影響在搖瓶和2 L反應(yīng)器中是相似的（圖2）。電荷異質(zhì)性方面，搖瓶實驗中主要產(chǎn)物和酸性變體都受到降溫工藝的顯著影響（p＜0.001），降低溫度會導(dǎo)致酸性變體含量降低（圖2a）。在2 L反應(yīng)器中，酸性變體含量受到降溫工藝的顯著影響，溫度降低引起酸性變體減少，并伴隨著主峰和堿性峰的相應(yīng)小幅度上升（圖2b）。N糖基化在搖瓶實驗中相對不受溫度轉(zhuǎn)換的影響，不同條件之間的變化的最大范圍小于4%（圖2c）。2 L反應(yīng)器實驗中，降溫僅會導(dǎo)致G0F的輕微增加（圖2d）。對于分子大小變異體，搖瓶實驗中發(fā)現(xiàn)降溫引起顯著差異，在較低的溫度下HMW增加，而不同降溫天數(shù)對HMW比例無顯著影響。溫度降低到32℃， HMW比例增加到約對照組的兩倍（圖2e）。2 L反應(yīng)器中分子大小變異體在不同降溫天數(shù)或不同降溫溫度下均無顯著差異，并且HMW比例均在2%左右（圖2f）。
圖2 細胞株A質(zhì)量屬性（電荷異質(zhì)性、N糖基化、分子大小變異體）搖瓶（a,c,e）;2 L反應(yīng)器（b,d,f）
▇▇ 細胞株A在降溫工藝優(yōu)化后的5 L規(guī)模和1,000 L大規(guī)模生產(chǎn)驗證
為了驗證降溫工藝的可放大性，在5 L反應(yīng)器中對比了有無降溫條件下的生產(chǎn)運行數(shù)據(jù)，并進一步在降溫工藝下進行1,000 L大規(guī)模生產(chǎn)驗證。
5 L反應(yīng)器中，對照組與實驗組細胞生長曲線整體相似（圖3a），只是采用降溫工藝后的VCD和細胞活率曲線略高于未降溫組（圖3a、b）。對照組在VCD峰值后存活率下降至約90%，幾天后增加，并在約10天開始再次下降直至最終大約90%；降溫實驗組細胞保持了95%以上的活率。VCD在峰值后持續(xù)下降，而活率仍然很高，這表明不健康細胞完全裂解。值得注意的是，降溫在第5天發(fā)生而蛋白滴度的提升直到第10天之后才顯現(xiàn)，此時實驗組中的抗體濃度明顯大于對照組（圖 3c）。實驗組的最終mAb1蛋白滴度比對照組高約25%。降溫后，葡萄糖的消耗量顯著降低（數(shù)據(jù)未顯示），但乳酸含量沒有受到顯著影響（圖3d）。降溫后氧氣通量顯著降低（圖3e）以保持40%溶氧設(shè)定。pCO2隨溫度變化略有增加，但是到生產(chǎn)結(jié)束時，兩條件之間沒有顯著差異（圖3f）。
圖3 5 L反應(yīng)器中降溫（Day5，32℃）與未降溫的生產(chǎn)運行數(shù)據(jù)（a）VCD（b）活率（c）滴度（f）乳酸濃度（e）氧通量（f）CO2分壓
表1 5 L反應(yīng)器蛋白質(zhì)量屬性對比
5 L反應(yīng)器中的蛋白質(zhì)質(zhì)量屬性與先前篩選實驗的相似。對于電荷異質(zhì)性，mAb1的主峰和酸性峰受到的影響最大（表1）。主峰增加了約△13%，而酸性變體則相應(yīng)減少，堿性峰無顯著變化。大多數(shù)N糖基化種類具有顯著統(tǒng)計學差異。然而，觀察到的最大差異是G0F變化小于△5%，這不會引發(fā)臨床問題。G0和Man5比例在降溫和未降溫條件下差異最顯著，在降溫工藝下，G0增加約△0.8%，Man5減少約△1.1%。分子大小變異體遵循與初始篩選實驗類似的趨勢，HMW含量從1.6%增加到2.6%，增幅較小，下游純化能夠去除。
表2 1,000 L反應(yīng)器抗體質(zhì)量屬性
在1,000 L臨床生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用此前的降溫工藝。VCD 曲線和細胞活率與 5 L 生物反應(yīng)器規(guī)模相似，第 5 天左右達到峰值 VCD 約為 25E6 /mL，最終活率大于 95%（圖 4）。降溫工藝引起的最終滴度的提高也可從5 L規(guī)模轉(zhuǎn)移至1,000 L生物反應(yīng)器規(guī)模，相對于對照組，滴度增加了約25%。分析蛋白質(zhì)量屬性發(fā)現(xiàn)所有質(zhì)量指標都與5 L反應(yīng)器有類似的趨勢。相對于降溫工藝下5 L生物反應(yīng)器中酸性峰和主峰的含量分別為25.1±1.0%和63 ± 2.2%，1,000 L中酸峰為21.1 ± 1.2%，主峰相應(yīng)增加到70.3 ±3.0%（表2）。
圖4 1,000 L反應(yīng)器生產(chǎn)運行數(shù)據(jù)
▇▇ 降溫工藝對于細胞株B產(chǎn)量和質(zhì)量屬性的影響
對同屬CHO GS K1細胞系的細胞株B進行了類似的全因子降溫工藝篩查。在第3天或第6天，將溫度從36.5℃降低到30℃，32℃或34℃，并與未降溫的對照組進行比較。
細胞株B的生長曲線顯示，在第3天的指數(shù)生長期進行降溫，所有轉(zhuǎn)換溫度下的VCD值均明顯降低（圖5a）。在第6天進行轉(zhuǎn)換，三種溫度下的實驗組均可達到與對照組相近的的VCD峰值，并在此后的培養(yǎng)中保持略高的VCD。與細胞株A類似，相對于對照組，在任一降溫工藝條件下的細胞株B的活率在生產(chǎn)后期中都保持在更高的水平（圖5b）。就抗體滴度而言，除了在第6天降溫至34℃的產(chǎn)量不顯著低于對照組，其他降溫的實驗組最終滴度都受到顯著負面影響。與對照相比，降溫至30℃和32℃均使抗體單位產(chǎn)率降低，而小幅降至34℃沒有顯著影響。活細胞密度積分（IVCD）顯示出與VCD圖譜相似的趨勢，即第3天降溫的實驗組IVCD低于對照組而在第6天降溫的實驗組IVCD略高于對照組（圖5e）。
圖5 有無溫度轉(zhuǎn)換細胞株B的生長情況及抗體產(chǎn)量
分析產(chǎn)物的mAb2質(zhì)量屬性。對于電荷異質(zhì)性，降溫工藝會對mAb2的電荷變量分布產(chǎn)生顯著影響（圖6a）。溫度降低更多，或降溫時間提前，酸性峰顯著減少，堿性峰增加。電荷變量變化的最終結(jié)果是，主要產(chǎn)物在小幅度降溫條件下最高（第6天降至34℃），而在降溫較多或降溫較早的條件下（第3天為32和30℃）顯著削減。N糖基化僅受第3天早期溫度變化的顯著影響（圖6b）。通過多變量方差分析，最終降溫不是一個顯著因素。在細胞系B中，降溫工藝不會影響分子大小變異體的比例，無論是實驗組還是對照組，HMW含量都小于1%（圖6c）。
圖6 細胞株B的質(zhì)量屬性（a）電荷異質(zhì)性（b）N糖基化（c）分子大小變異體
▇▇ 討論
許多研究表明，可以通過降溫減少酸性電荷變量。本研究也表明，盡管對這兩種細胞株產(chǎn)量的影響不同，但 mAb1 和 mAb2 的酸性電荷變量隨著溫度的降低而顯著降低（圖 2a、b 和 6a）。據(jù)推測，降溫條件下蛋白質(zhì)酸性變體的減少是由減慢的降解動力學或提高的細胞活率引起的，這可以防止可能損壞最終產(chǎn)物的降解酶的釋放。細胞株 B 的 mAb2 主峰增加而最終滴度沒有增加，這表明降溫工藝可能在蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中主要起提高質(zhì)量而不提高產(chǎn)率的作用。兩種細胞系之間的降溫時間的影響也不同。在兩個篩選實驗中，降溫時間都不對mAb1 電荷異構(gòu)體產(chǎn)生顯著影響（圖 2a、b）。對于細胞株B，第3天降溫比第6天降溫對堿性峰有更強的影響（圖 6a），這可能與細胞系 B 早期降溫造成的細胞生長抑制有關(guān)（圖 5a、e）。低溫下細胞系 B 的 mAb2 堿性峰增加可能是由于羧肽酶表達降低，導(dǎo)致的C 末端賴氨酸不完全裂解?？偠灾?，降溫對電荷變量的影響主要是由降低溫度的多少驅(qū)動的，而不是降溫時間。
其他蛋白質(zhì)質(zhì)量屬性，包括 N糖基化和分子大小變異體，都受到降溫工藝的影響，并且兩種細胞系之間的影響也不同。mAb1 的 N糖基化相對不受降溫工藝的影響。mAb1 的實驗組與對照組之間最顯著的差異是 G0 和 Man5 的變化，包括大約 △1% 的差異和半乳糖基化的輕微降低。mAb2 的糖基化受到早期第 3 天降溫的顯著影響，這導(dǎo)致半乳糖基化減少類似于 mAb1，G1F 和 G2F 分別減少 &△5% 和 &△0.8%，G0F 相應(yīng)增加 &△3%（圖 6b）。關(guān)于分子大小變異體，mAb1的HMW比例在較低降溫下而增加了約兩倍（圖 2e、f），但相對于對照組，所有降溫工藝下的mAb2 的 HMW 比例沒有顯著變化（圖 6c）。mab2的LMW在所有條件下均不受降溫工藝的影響，并且在所有測試條件下兩種細胞系的 LMW 均低于 1%。降溫工藝對 mAb1 和 mAb2 之間聚集的不同影響不足為奇，因為一些文獻報告稱在降溫工藝下聚集體增加，有些聚集體減少，或兩者都有，具體取決于其他工藝參數(shù)。降低培養(yǎng)溫度可能增加或減少聚集的確切機制很復(fù)雜，不容易歸因于任何單一原因。
降溫工藝可以從多方面促進蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。本研究成功將搖瓶篩選實驗中確定的降溫條件放大至5 L反應(yīng)器規(guī)模（圖 1、3）并擴大到 1,000 L生產(chǎn)規(guī)模，同時在 mAb1 生產(chǎn)率和蛋白質(zhì)質(zhì)量方面取得了類似的改進（圖 4 和表 2）。降溫工藝的一個常見好處是提高某些細胞系的生產(chǎn)力和最終滴度，本研究中細胞系 A 的最終 mAb1 滴度提高了 25% 以上（圖 3c）。盡管 mAb2 的滴度沒有隨著溫度變化而提高（圖 5c），降溫工藝卻可能有助于控制蛋白質(zhì)量（圖 6a）。在這兩種細胞系中，最終細胞活率在所有降溫工藝下都保持更高水平。這可能使得死亡和膜受損細胞釋放的宿主細胞蛋白種類減少，被蛋白酶降解的可能性降低，從而減輕下游純化的負擔。研究發(fā)現(xiàn)，降溫后細胞株 A 的單位葡萄糖攝取率降低而乳酸曲線與對照組（圖 3d）沒有顯著差異，抗體滴度增加可以推測出：隨著溫度變化，細胞株 A 的能量更有效地重新分配到產(chǎn)物形成上去。其次降溫工藝減少了氧通量（圖 3e），很可能是由于低溫下細胞代謝減少和氧氣溶解度增加所致。降低氧氣流速在大規(guī)模生產(chǎn)中尤為重要，可以減少氣泡對細胞的切割破壞，反應(yīng)器起泡和供氧問題。
總之，本研究證明了將降溫工藝納入蛋白生產(chǎn)流程有很多好處，并且即使在沒有滴度提高的情況下，溫度變化也可能對控制質(zhì)量屬性有幫助。
參考文獻：
McHugh KP, Xu J, Aron KL, Borys MC, Li ZJ. Effective temperature shift strategy development and scale confirmation for simultaneous optimization of protein productivity and quality in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Prog. 2020 May;36(3):e2959. doi: 10.1002/btpr.2959. Epub 2020 Jan 17. PMID: 31930722.
