01-宿主細胞蛋白(HCP)
中國藥典(ChP)規(guī)定HCP殘留量應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.01%。美國藥典(USP)規(guī)定單抗制品中殘留HCP不得超過100 ppm,其它蛋白類藥物其所允許的HCP一般也低于100 ppm。
02-HCP殘留檢測方法
商品化的ELISA試劑盒中的多克隆抗體能夠識別大多數(shù)HCP混合物中的蛋白質(zhì),但可能無法檢測特定制造過程中的HCP成分。通過ELISA法檢測HCP殘留的準(zhǔn)確性主要依賴于多克隆抗體對HCP的覆蓋率。因此,監(jiān)管機構(gòu)要求在治療性蛋白產(chǎn)品在商業(yè)化申報之前,用于檢測HCP殘留的多克隆抗體對于產(chǎn)品中HCP的覆蓋率需要經(jīng)過驗證。
03-HCP抗體覆蓋率驗證
3.1. HCP 抗體覆蓋率檢測方法
USP <1132>章節(jié)闡述了兩種用于測定ELISA試劑盒中多克隆抗體對HCP覆蓋率的方法,一種是二維凝膠電泳后連用免疫印跡分析(2-D SDS-PAGE/Western blot, 2D-WB),另一種是免疫親和結(jié)合后連用凝膠電泳技術(shù)(Immunoaffinity binding/1- or 2-D SDS-PAGE)。第一種方法通過對比免疫印跡染色點數(shù)與經(jīng)熒光染色或銀染獲得的總蛋白點數(shù)來獲得抗體覆蓋率(如Figure 1所示)。第二種方法通過對比樣品從固定了HCP抗體的凝膠柱上流穿和洗脫的蛋白數(shù)量計算抗覆蓋率。
Figure 1- Left panel: 2-D IEF/SDS-PAGE analysis of representative CHO HCP calibration standard stained with a sensitive fluorescent. Right panel: Western blot analysis of the same gel shown in the left panel. (Excerpt from USP <1132>)
3.2. 雙向差異熒光印記法(2D-DIBE)
雙向差異熒光印記法(2D-DIBE)是測定ELISA試劑盒中抗體的覆蓋率的常用方法,是2D-WB方法的改進,其主要的操作步驟如下。
HCP首先通過第一維的等電聚焦電泳依據(jù)等電點分離帶不同性質(zhì)電荷的蛋白,隨后轉(zhuǎn)移至第二維的SDS-PAGE凝膠電泳,依據(jù)蛋白分子量大小不同進行分離。經(jīng)過兩個維度的電泳分離,極大的提高了HCP的分離效果。
二維凝膠電泳原理如Figure2所示:
Figure 2 - Schematic of Two-dimensional gel electrophoresis
Western blot原理如Figure3所示:
Figure 3 - Schematic of Western blot
由于蛋白熒光信號和與HCP抗體結(jié)合的二抗信號在同一張膜上顯示,避免了兩張膜不同分離效果帶來的差異。可以利用軟件方便的進行圖像疊加和數(shù)據(jù)分析,準(zhǔn)確匹配兩者重合的點數(shù)并計算抗體覆蓋率:
總蛋白點數(shù)=SYPRO Ruby染色識別點數(shù)+Western blot信號點數(shù)-兩者重合的點數(shù)
抗體覆蓋率= Western blot信號點數(shù)/總蛋白點數(shù)×100%
04-賦成生物HCP抗體覆蓋率驗證平臺介紹
(A: SYPRO Ruby detection profile of Kit 1; B: SYPRO Ruby detection profile of Kit 2; C: Western blot detection profile of Kit 1; D: Western blot detection profile of Kit 2 )
( Red signal: SYPRO Ruby signal; Green signal: Western blot signal )
參考文獻
[1].Slaney, Thomas, Song, et al. Identification of a host cell protein impurity in therapeutic protein, P1[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis: An International Journal on All Drug-Related Topics in Pharmaceutical, Biomedical and Clinical Analysis, 2017;32-38.
[5].國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2020年版):三部, 尼妥珠單抗注射液[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2020.