雙功能抗體主要分為兩類：

? IgG like：保留了Fc片段，具有Fc介導(dǎo)的抗體效應(yīng)功能，如ADCC、CDC。代表平臺有Knob in hole、SEED、DEKK 、DVD-Ig、DAF、Crossmab 等幾十個平臺；

基于在抗體鏈的 CH3 區(qū)域用一個較大的氨基酸替換一個較小的氨基酸，形成一個“knob”結(jié)構(gòu)，同時在另一條鏈上以較小的氨基酸替換多個較大的氨基酸形成一個“hole”結(jié)構(gòu)，改變了 Fc 的局部空間結(jié)構(gòu)。杵臼結(jié)構(gòu)設(shè)計有利于兩種異源抗體重鏈的正確裝配。

賦成生物雙功能抗體表達(dá)平臺為以KIH為基礎(chǔ)進(jìn)行Fab或Fc改造而成，基于KIH的基礎(chǔ)分別在Fab端或Fc端增加scFv或納米抗體，從而達(dá)到雙抗或多抗靶向及治療效果。

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，可設(shè)計單細(xì)胞或雙細(xì)胞表達(dá)體系及工藝路線。

? 雙細(xì)胞表達(dá)體系：采用半抗分別表達(dá)、體外裝配的方式。

? 單細(xì)胞表達(dá)體系：采用單細(xì)胞表達(dá)體系，體內(nèi)裝配，純化目的蛋白。

2.2特色CD3平臺

? 采用特色ADCC增強型宿主細(xì)胞分別進(jìn)行半抗表達(dá)，并進(jìn)行體外裝配，形成雙功能抗體。

? 優(yōu)勢：可有效避免輕重鏈錯配情況；同時半抗分別表達(dá)可靈活搭配不同杵臼抗體。

3.1雙細(xì)胞表達(dá)平臺的蛋白表達(dá)及質(zhì)量屬性

? BsAb01-hole和BsAb01-knob表達(dá)量分別為3.28 g/L-3.73 g/L；

? 在半抗表達(dá)過程中，有15-47%的同源全抗，體外裝配后其半抗及HHL比例降低至5%以下，SEC-HPLC純度高達(dá)99.6%

3.2 In vitro study

? BsAb01的增殖抑制作用顯著優(yōu)于同靶點單抗及聯(lián)用；

? 其靶細(xì)胞抑制率高達(dá)80%以上，ADCC活性明顯強于同靶點單抗及聯(lián)用。

3.3 In vivo efficacy testing

? 在不同小鼠荷瘤模型中，BsAb01的腫瘤抑制效果明顯高于同靶點單抗。

4、雙功能抗體平臺的應(yīng)用 - 

單細(xì)胞表達(dá)平臺設(shè)計及應(yīng)用

? 雙抗設(shè)計理念：scFv通常由一個VH、一個VL、以及介于中間的接頭構(gòu)成，BsAb02在VL的C末端進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造（單鏈抗體scFv片段包含重鏈可變區(qū)、接頭和k輕鏈可變區(qū)）。同時在CH3區(qū)改造，形成 “杵臼”結(jié)構(gòu)（knob-in-hole）。

? 最終分子結(jié)構(gòu)：Fab-Fc(G1)×scFv-Fab-Fc(G1)。其中Fab-Fc(G1)部分為Target1半抗體，scFv-Fab-Fc(G1)部分為Target1 scFv與anti-CD3 Fab-Fc的重鏈N端連接組成的半抗體，雙特異抗體Fc端為杵臼結(jié)構(gòu)設(shè)計。

? 采用特色CD3抗體平臺，有效降低雙抗聚集傾向及免疫原性問題。同時輕鏈分別采用λ和κ，可有效避免輕重鏈錯配情況。

? 采用MGV表達(dá)體系，進(jìn)行單細(xì)胞表達(dá)。

4.1單細(xì)胞表達(dá)平臺的蛋白表達(dá)及傳代穩(wěn)定性評估

? BsAb02表達(dá)量約為4.71 g/L-5.64 g/L；

? 細(xì)胞經(jīng)過30 passages 傳代（>100PDL), 抗體關(guān)鍵質(zhì)量屬性未發(fā)生顯著變化。

? SEC純度>83%（一步親和）；nrCE-SDS和電荷異構(gòu)基本一致；N-glycans分布基本一致；生物學(xué)活性基本一致。

參考文獻(xiàn)

1、 Ma J, Mo Y, Tang M, Shen J (2021) .Bispecific Antibodies: From Research to Clinical Application. Front. Immunol. 12:626616.

2、 雙特異性抗HER2抗體（CN 109715671 B）