將Fed-Batch培養(yǎng)（搖瓶）結(jié)束時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)液離心獲得CCS，并將其分成30 ml等分試樣。實(shí)驗(yàn)組使用細(xì)胞培養(yǎng)后期的培養(yǎng)條件（pH為6.75，溫度為29 °C），直接孵育CCS；對(duì)照組通過將純化的Fc融合蛋白加入新鮮培養(yǎng)基中，最終蛋白濃度接近1200 mg/L（與CCS組的濃度水平相同）。對(duì)于唾液酸和金屬離子抑制研究：將游離NANA和兩種氧化還原活性金屬離子Cu²⁺和Co²⁺添加到CCS中；對(duì)于pH梯度的條件設(shè)定，加入NaHCO3或HCl將pH調(diào)節(jié)至6.75、6.90、7.05或7.20；對(duì)于溫度梯度的條件設(shè)定，CCS在4個(gè)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在29 °C、32 °C、35 °C或37 °C，其他參數(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)條件相同。將CCS過濾到無菌細(xì)胞培養(yǎng)管中，并在CO2培養(yǎng)箱中孵育（Cell free實(shí)驗(yàn)）。所有的培養(yǎng)箱都用5%CO2填充，以保持CCS的pH值。每天從CCS中取樣，立即檢測(cè)pH值，并在純化后測(cè)定唾液酸含量和N-聚糖糖型分布。

結(jié)果顯示唾液酸含量隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，在第6天達(dá)到其原始水平的87.54±0.53%，并且在剩余的孵育時(shí)間內(nèi)不再變化（圖1）。當(dāng)Fc融合蛋白在新鮮培養(yǎng)基中孵育時(shí)，唾液酸含量沒有隨時(shí)間變化。

Fig. 1. Time course of sialic acid content in the Fc-fusion protein during cell free incubation (n=3). Data were normalized to the initial sialic acid content in the cell free experiment.

通過NP-HPLC分析Fc融合蛋白的N-聚糖組成[1]。如圖2所示，F(xiàn)c融合蛋白由主要典型的雙觸角復(fù)合物N-聚糖和極少數(shù)的三觸角及四觸角唾液酸化聚糖組成（不到總百分比的2%）。將雙觸角復(fù)合物N-聚糖分離為10個(gè)主要結(jié)構(gòu)。圖3顯示了在Cell free培養(yǎng)過程中這些N-聚糖結(jié)構(gòu)的變化。發(fā)現(xiàn)單唾液酸化（A1和A1F）和二唾液酸化N-聚糖（A2和A2F）的百分比顯著降低。相應(yīng)地，去唾液酸化糖型（G2和G2F）的百分比增加。除了唾液酸化外，F(xiàn)c融合蛋白的半乳糖基化、巖藻糖基化和其他N-聚糖種類在Cell free孵育期間保持不變。這些結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，聚糖上的其他單糖不受CCS中培養(yǎng)基成分或相關(guān)糖苷酶的影響。因此，蛋白中唾液酸被CCS中的細(xì)胞外唾液酸酶水解。

Fig. 2. The NP-HPLC N-glycan profile of the Fc-fusion protein.

Fig. 3. The change in the main N-glycan distribution of the Fc-fusion protein after cell free incubation, *p<0.05, **p<0.01 relative to the initial status before incubation (n=3).

▊▊ 常見抑制因子對(duì)胞外唾液酸降解的影響

 游離唾液酸 

 金屬離子 

氧化劑可能使細(xì)胞外CHO細(xì)胞唾液酸酶不穩(wěn)定[2]。二價(jià)金屬離子Cu²⁺和Co²⁺是氧化還原活性和潛在的唾液酸酶抑制劑，也被添加到CCS中，以研究它們對(duì)唾液酸降解的抑制作用。在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，Cu²⁺和Co²⁺分別在1 mM和2.5 mM以上可以完全抑制細(xì)胞外唾液酸酶活性（圖4A），相比之下，在沒有額外金屬離子的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，唾液酸降解率為11.77±0.64%（在培養(yǎng)基中為0.48μM Cu²⁺和無Co²⁺）。同時(shí)，至少需要0.2mM Cu²⁺和0.5mM Co²⁺來減少CCS中的唾液酸降解，以使唾液酸含量分別下降7.39±0.99%和8.69±0.58%。

據(jù)報(bào)道，F(xiàn)c融合蛋白的錯(cuò)誤折疊形式在培養(yǎng)過程中表達(dá)，并導(dǎo)致最終蛋白產(chǎn)物的生物活性較低[3-4]。在該研究中的Fc融合蛋白生產(chǎn)過程中也發(fā)現(xiàn)了錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)部分（35-40%）。盡管Cu²⁺和Co²⁺在抑制Fc融合蛋白的唾液酸降解方面是有效的，但孵育后，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)組分的比例從33.83±0.44%（未添加）顯著增加到36.45±0.46%（0.2mM Cu²⁺）和39.96±0.88%（1.0mM Cu²⁺）（圖4B），而CCS對(duì)照組和Co²⁺添加組沒有變化。除了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化外，F(xiàn)c融合蛋白在與Co²⁺孵育后的顏色變紅（圖4C），表明可能形成了Co²⁺-蛋白復(fù)合物。這些發(fā)現(xiàn)表明，當(dāng)Cu²⁺和Co²⁺用于抑制細(xì)胞外唾液酸降解時(shí)，它們改變了Fc融合蛋白的結(jié)構(gòu)和顏色。

Fig. 4. Effect of NANA and divalent metal ion addition on (A) sialic acid degradation,(B) misfolded form1 and (C) protein color2 of the Fc-fusion protein after cell free incubation. Sialic acid content was normalized to the initial sialic acid content in the cell-free experiment. *p<0.05 relative to the initial status before incubation (n=3). 1, Misfolded Fc-fusion protein was analysed by HIC-HPLC. 2, Samples were treated for 5 mins at 100 °C to denature the Fc-fusion protein.

 溫度 

為了研究溫度對(duì)唾液酸降解的影響，在四種常用溫度下進(jìn)行了Cell free實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖所示(圖第5A段)。唾液酸在35 °C和37 °C下的前24小時(shí)水解率分別為5.47±0.49%和5.29±0.46%，在29 °C 時(shí)為4.18±0.08%，32 °C時(shí)為3.88±0.37%。在延長(zhǎng)的孵育過程中，35 °C和37 °C下的降解速率迅速下降，在低溫條件下（29 °C和32 °C）降解速率變慢（圖第5A段）。最后，在低溫條件下，唾液酸的總降解率在29 °C下為11.52±0.47%，在32  °C時(shí)為10.77±0.50%，相比之下，35 °C下和37 °C下培養(yǎng)后的降解率分別為8.69±0.53%和8.33±0.49%。還檢測(cè)到唾液酸化的N-聚糖，如表1所示。從29 °C到37 °C，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)單唾液酸化和二唾液酸化組分減少?？傊?，細(xì)胞外唾液酸酶活性在輕度低溫條件下比在35 °C和37 °C下更低，但更穩(wěn)定，導(dǎo)致在輕度低溫下Cell free培養(yǎng)過程中唾液酸降解更多。

1.The incubation pH was 6.75 in the temperature-gradient cell-free experiments.

2.The incubation temperature was 29 °C in the pH-gradient cell-free experiments.

 pH 

使用CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中四種常用pH條件組成的Cell free實(shí)驗(yàn)來了解環(huán)境pH與唾液酸降解之間的關(guān)系。通過直接向CCS中加入NaHCO3或HCl來實(shí)現(xiàn)pH梯度，并且使用NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)在培養(yǎng)的6天內(nèi)pH值是恒定的。如圖6所示，如圖5B所示，CCS中的唾液酸降解受到pH升高的抑制，并且在pH=7.05（2.67±0.16%）和7.20（1.41±0.32%）時(shí)觀察到唾液酸降解水平非常低。相比之下，在pH6.90和6.75時(shí)7.42±0.18%和10.22±0.20%唾液酸被水解。

對(duì)于唾液酸化的N-聚糖，在升高的pH下孵育后，單唾液酸化和二唾液酸化的N聚糖的量減少較?。ū?）。這些結(jié)果表明，在pH超過7.05的CCS中，可以顯著防止細(xì)胞外唾液酸降解。

Fig. 5. Time course of sialic acid content level of the Fc-fusion protein during cell-free incubation under different (A) temperature and (B) pH conditions (n=3). Data were normalized to the initial sialic acid content in the cell-free experiment.

▊▊ 通過工藝控制減少唾液酸的降解

對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行研究和調(diào)整，以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和蛋白質(zhì)量屬性。為了證實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH對(duì)蛋白質(zhì)唾液酸化的影響，在生物反應(yīng)器中應(yīng)用了三種不同的pH設(shè)置（6.85、6.95和7.10）。在pH值為6.85±0.05時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)顯著下降，最大活細(xì)胞密度為7.16±0.48×10⁶個(gè)cells/ml，而在pH為6.95±0.05時(shí)為9.81±0.60×10⁶個(gè)cells/ml，在pH為7.10±0.05時(shí)則為9.12±0.29×106個(gè)cells/ml（圖6A）。當(dāng)培養(yǎng)過程中，活細(xì)胞密度保持約三天（第6天至第9天），然后活力持續(xù)下降至D13培養(yǎng)結(jié)束（圖第6B段），最終細(xì)胞活率分別為80.46±0.93%（pH=6.85±0.05）、82.01±1.72%（pH=6.95±0.05%）和82.34±0.83%（pH=7.10±0.05）。從培養(yǎng)第9天開始，當(dāng)細(xì)胞活力開始下降時(shí)，監(jiān)測(cè)唾液酸含量和N-聚糖譜。如圖6D所示，唾液酸含量在pH為7.10±0.05條件下幾乎保持不變，最終在第13天達(dá)到95.17±0.83%。

相反，在其他兩種條件下，唾液酸含量從第9天的100.00±1.14%顯著降低到第13天的88.57±1.53%（pH為6.85±0.05）和從第9天99.83±0.67%到第13天90.23±1.13%（pH值為6.95±0.05）。IEF-PAGE結(jié)果顯示：更多的唾液酸導(dǎo)致堿性電荷蛋白質(zhì)組分減少，在pH為6.85±0.05和6.95±0.05的培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了更多的堿性電荷蛋白質(zhì)。相比之下，電荷分布在pH 7.10±0.05時(shí)幾乎保持恒定，這反映了培養(yǎng)后期唾液酸含量的穩(wěn)定性。對(duì)于唾液酸化的N-聚糖，從第9天到第13天，單唾液酸化和二唾液酸化組分在7.10±0.05的pH下幾乎沒有變化，這反映了觀察到的唾液酸含量的穩(wěn)定性，并且它們?cè)谄渌麅煞N條件下不斷降低（圖6E和F）。最后，在pH為7.10±0.05時(shí)，單唾液酸化和二唾液酸化N-聚糖的百分比分別為25.92±0.43%和6.92±0.37%，顯著高于pH為6.85±0.05時(shí)的22.94±0.45%和4.93±0.27%以及pH為6.95±0.05的23.57%±0.31%和5.20%±0.23%。此外，在三種pH條件下，對(duì)Fc融合蛋白的聚集、錯(cuò)誤折疊形式的百分比和斷裂的影響最?。ū?）。這些數(shù)據(jù)表明，在較高的pH條件下，CCS中的唾液酸降解大多受到抑制，這些結(jié)果可用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中唾液酸含量的降低。

Fig. 6. Profile of (A) viable cell density, (B) viability, (C) Fc-fusion protein titer, (D) sialic acid content level, (E) mono-sialylated N-glycans and (F) di-sialylated N-glycans in the Fc-fusion protein during fed-batch bioreactor culture with different pH levels. *p<0.05, **p<0.01 relative to pH=7.10±0.05 (n=3). Sialic acid content data were normalized to day 3 of pH=6.85±0.05.

Table2  Effect of different bioreactor pH control on other critical quality attributes of the Fc-fusion protein

1. Misfolded form was analysed by HIC-HPLC.

2. Aggregation was analysed by SEC-HPLC.

3. Fragmentation was analysed by non-reduced CE-SDS. N.D: not detected.

▊▊ 討論

在pH梯度Cell free實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在pH值超過7.05時(shí)，CCS中的細(xì)胞外唾液酸酶活性受到顯著抑制。作為一個(gè)關(guān)鍵的工藝參數(shù)，考慮到細(xì)胞性能和產(chǎn)品質(zhì)量屬性，pH值始終調(diào)整在6.8至7.2的范圍內(nèi)。通過生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)，證明在CHO細(xì)胞Fed-batch培養(yǎng)的后期，將pH控制在7.05以上對(duì)于保持產(chǎn)物唾液酸化穩(wěn)定是可行的。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞活力、蛋白質(zhì)生產(chǎn)或其他質(zhì)量屬性與pH值在6.90和7.10之間沒有顯著差異。但與6.90的pH相比，將外部pH升高至7.10和7.20降低了Epo-Fc過程中的唾液酸含量，并且在培養(yǎng)的后期，更高水平的唾液酸酶被釋放到CCS中，并且CCS的環(huán)境更加復(fù)雜。細(xì)胞外唾液酸酶對(duì)產(chǎn)物唾液酸化的影響似乎是一個(gè)不可忽視的問題，它決定了糖蛋白的最終唾液酸含量。這項(xiàng)研究結(jié)果表明，將pH控制在更高的值是一種有效的策略，可以應(yīng)用于高密度的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，以抑制產(chǎn)物唾液酸的降解，并為CHO細(xì)胞生物過程的設(shè)計(jì)提供更多信息，以獲得更好的蛋白質(zhì)質(zhì)量。

▊▊ References

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