▊▊ 引言
穩(wěn)定的配方是生物大分子藥物成功開發(fā)的關(guān)鍵。成功的配方不僅能夠保證臨床效果，而且可以提高藥物的可生產(chǎn)性和穩(wěn)定性。生物大分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，構(gòu)象穩(wěn)定性體現(xiàn)了其在不同條件下維持自身高級(jí)結(jié)構(gòu)的能力，是決定其可開發(fā)性的關(guān)鍵屬性之一。因此在配方開發(fā)過程中，構(gòu)象穩(wěn)定性成為篩選最優(yōu)配方的關(guān)鍵指標(biāo)。
差示掃描熒光法（DSF）利用環(huán)境敏感的染料（如SYPRO Orange）與蛋白質(zhì)疏水區(qū)域結(jié)合后熒光強(qiáng)度的變化，進(jìn)行構(gòu)象穩(wěn)定性的評(píng)估。在水溶液中游離的染料產(chǎn)生的信號(hào)十分微弱，可以忽略不計(jì)，但是一旦存在解折疊的蛋白質(zhì)，熒光染料就可以和解折疊的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域相結(jié)合，產(chǎn)生顯著的熒光信號(hào)。與DSC方法相比，DSF方法具備以下特點(diǎn)：
4）檢測時(shí)間短
除此之外，DSC對(duì)于蛋白質(zhì)濃度范圍通常有一定的限制， DSF則可以對(duì)0.05-200 mg/mL濃度范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，而對(duì)于蛋白藥物考察其在長期貯存的配方濃度條件下的穩(wěn)定性是更加關(guān)鍵和必要的。我司利用DSF方法，對(duì)抗體類藥物常用抗體配方進(jìn)行了大規(guī)模的篩選考察，并利用強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)，研究了DSF與其他方法的相關(guān)性。
▊▊ 大規(guī)模配方篩選
采用單克隆抗體mAb 1 (單抗，IgG 1, pI 9.1)，考察表 1所示緩沖體系和輔料類型及濃度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用DOE的方式進(jìn)行，根據(jù)4種緩沖鹽種類設(shè)計(jì)4組DOE試驗(yàn)，采用1/4析因、分辨度Ⅳ，共80組配方。全部配方采用DSF方法檢測Th(蛋白質(zhì)疏水暴露溫度the transition temperature of exposure of the hydrophobic regions of proteins)，并對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行匯總分析，如圖1所示。
通過對(duì)主效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，在所有緩沖體系中，pH值為影響抗體Th值的最顯著的因素，且Th值呈現(xiàn)出隨著pH的增加而增加的趨勢(shì)，在章節(jié)3中，我們對(duì)這種趨勢(shì)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
配方中緩沖鹽濃度通常在0.01 M-0.02 M之間，最低緩沖鹽濃度達(dá)到0.003 M，最高濃度可以達(dá)到0.10 M。在本次試驗(yàn)中考察了0.01-0.03 M緩沖鹽濃度對(duì)抗體熱穩(wěn)定的影響，高濃度（0.03 M）的緩沖鹽對(duì)抗體的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生了不利影響，在0.02 M緩沖鹽濃度下可以獲得最高的Th值，此濃度也是抗體藥物配方中常見的緩沖鹽濃度。
表面活性劑為抗體類藥物配方的重要組成部分，可以避免聚集體的產(chǎn)生，并且顯著降低蛋白質(zhì)在包裝容器中儲(chǔ)存及臨床用藥過程中受到的界面吸附影響。抗體配方中最常用的表面活性劑為聚山梨酯20（PS20）和聚山梨酯80（PS80），此外部分藥物中添加了泊洛沙姆188 （P188），另有少量藥物配方中不含表面活性劑。本次試驗(yàn)中考察了在含有PS20和PS80配方下的mAb 1熱穩(wěn)定性情況，結(jié)果顯示在不同的緩沖體系下含PS80配方的抗體Th值均高于PS20的配方，其中在磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖體系中，表面活性劑種類為影響Th值的顯著因素。中等濃度（0.03%）的表面活性劑對(duì)抗體的保護(hù)效果優(yōu)于低濃度（0.01%）的情況，但更高濃度（0.05%）的吐溫含量并不能提供更優(yōu)的保護(hù)效果。
糖類是抗體藥物配方中的另一個(gè)重要輔料，在凍干過程中提供網(wǎng)狀，玻璃態(tài)、無定形的基質(zhì)。目前認(rèn)為糖類穩(wěn)定抗體的機(jī)制包括通過水分子排除假說，玻璃化理論和降低局部及全部的流動(dòng)性。在溶液中，蔗糖和海藻糖通過優(yōu)先排除機(jī)制發(fā)揮作用。根據(jù)DSF結(jié)果顯示，在不同緩沖體系下，蔗糖與海藻糖對(duì)Th的影響幾乎相當(dāng)，且中等濃度（240 mM）的糖含量更有利于抗體獲得較高熱穩(wěn)定性。
表1 配方考察內(nèi)容
圖1 四種緩沖體系的主效應(yīng)因子圖
▊▊ pH值對(duì)抗體Th的影響
在章節(jié)2中發(fā)現(xiàn)在不同緩沖體系下，抗體的Th值均存在隨pH的升高而上升的情況。由于配方pH的選擇與抗體等電點(diǎn)pI相關(guān)，因此選取不同等電點(diǎn)的抗體mAb 2 (單抗，IgG 4, pI 6.4)、mAb 3 (單抗，IgG 4, pI 7.4)、BsAb 4 (雙抗，IgG 4, pI 9.0)采用DSF進(jìn)行Th的檢測，如圖2所示。結(jié)果顯示低、中、高等電點(diǎn)的樣品均存在Th隨pH升高而上升的規(guī)律。
研究表明，抗體不同的結(jié)構(gòu)域?qū)嵴T導(dǎo)和pH誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的敏感度不同，隨著pH的降低，F(xiàn)c區(qū)域首先受到影響，F(xiàn)ab區(qū)域在更極端的pH下才會(huì)變性。DSF主要檢測的為Fc區(qū)域中CH2結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性變化，因此呈現(xiàn)出圖 2和圖 3所展示的規(guī)律。在低pH下的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變被認(rèn)為是氨基酸側(cè)鏈的質(zhì)子化導(dǎo)致的，相較于自然狀態(tài)結(jié)構(gòu)，新生成的結(jié)構(gòu)相對(duì)更為緊密，因此并不會(huì)形成更多的聚體。由于發(fā)現(xiàn)了這樣的規(guī)律，因此DSF方法并不適宜單純的用于含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的抗體配方pH的篩選。
▊▊ DSF與其他方法的相關(guān)性及對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的預(yù)測能力
DSF利用解折疊蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域與熒光染料的結(jié)合信號(hào)來進(jìn)行Th值的檢測，因此DSF可以用于預(yù)測輔料對(duì)解折疊誘導(dǎo)的聚集體的產(chǎn)生的影響。聚集體含量的變化主要體現(xiàn)在SEC-HPLC、不溶性微粒。采用BsAb 4作為考察目標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)方式設(shè)計(jì)5種配方，將不同配方下的BsAb 4樣品在40°C放置7天，考察樣品的聚體、微粒及Th變化。表 2為單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，圖4-圖6展示了40°C，7天內(nèi)樣品聚體、微粒及Th的變化情況。
Th結(jié)果顯示配方2和配方5的熱穩(wěn)定性低于其他3組配方，觀察SEC-HPLC和不溶性微粒檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)配方2和配方5經(jīng)過高溫7天處理，分別出現(xiàn)SEC-HPLC碎片峰和聚體峰顯著升高的現(xiàn)象，配方2在高溫7天時(shí)的不溶性微粒數(shù)量高于配方1、3、5。DSF和SEC-HPLC、不溶性微粒檢測結(jié)果基本一致，表明了三者之間具有一定的相關(guān)性。隨高溫條件放置，初始Th較低的配方表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性，說明該方法可以在一定程度上預(yù)測樣品長期放置的穩(wěn)定性情況。
▊▊ 總結(jié)
DSF能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的有效數(shù)據(jù)，結(jié)合DOE的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以在項(xiàng)目早期對(duì)大范圍影響因素和條件進(jìn)行考察，分析多種因素對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響情況，從而縮小配方開發(fā)的篩選范圍，提高配方開發(fā)速度。同時(shí)DSF所需的儀器設(shè)備簡單，生物制藥實(shí)驗(yàn)室常見的qPCR儀即可滿足檢測需求，大大減少了開發(fā)所需的時(shí)間和資源，具有極高的推廣利用價(jià)值。
參考文獻(xiàn)
[1]High throughput thermostability screening of monoclonal antibody formulations[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010, 99(4):1707-1720.
