1、低pH孵育病毒滅活簡(jiǎn)介
在生物制品生產(chǎn)工藝中，病毒去除和滅活是至關(guān)重要的一個(gè)工藝步驟，CDE《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則》及ICH Q5A《來(lái)源于人或者動(dòng)物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的病毒安全性評(píng)估》中明確規(guī)定來(lái)源于動(dòng)物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品至少需要兩種不同原理的病毒滅活/去除的步驟來(lái)保證產(chǎn)品無(wú)病毒污染。在抗體工藝流程設(shè)計(jì)中，典型的設(shè)計(jì)是在Protein A親和層析后加上低pH孵育病毒滅活的工藝，低pH是最常用的病毒滅活方法，此方法相對(duì)簡(jiǎn)單、占地面積小并且通常不需要干預(yù)或者附加步驟即可滅活病毒。一個(gè)典型的病毒滅活操作包括酸化（VIA）和中和（VIN）步驟，親和層析產(chǎn)物被調(diào)整到 pH 值3.6左右，并保持一段時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)足夠的病毒滅活，調(diào)節(jié)到接近中性的 pH 值（VIN），以便下一步處理。
2、研究意義
在IgG4單克隆抗體（mAb IgG4-N1）的低pH病毒滅活（VI）放大過(guò)程中，觀察到大量可溶性產(chǎn)物聚集，而在相同條件下的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)顯示聚集可忽略不計(jì)。混合不均勻和產(chǎn)品暴露于低pH被確定為根本原因。為了解釋該問(wèn)題的機(jī)理，通過(guò)改變關(guān)鍵參數(shù)（包括pH、放置時(shí)間和蛋白質(zhì)濃度）來(lái)研究蛋白質(zhì)聚集特性。
此研究通過(guò)將IgG4-N1的分子性質(zhì)和各種過(guò)程相關(guān)參數(shù)與宏觀聚集現(xiàn)象聯(lián)系起來(lái)，揭示了其在酸性條件下的主要聚集機(jī)制。這項(xiàng)研究還為下游VI操作中低pH誘導(dǎo)IgG4聚集的原因和緩解策略提供了有用的建議。
使用含有66.5 L PAE（親和層析洗脫收集液）且葉輪攪拌速度為50 rpm的SUM-100 Mixer進(jìn)行IgG4-N1放大生產(chǎn)的VI。如表1所示，VIA和VIN樣品的HMW聚集水平分別為1.7%和7.1%。VIN樣品中的聚體量超過(guò)了IPT標(biāo)準(zhǔn)，并導(dǎo)致該批次生產(chǎn)失敗。
隨后進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模試驗(yàn)，以模擬放大條件。在50 mL小燒杯中使用與放大操作相同的酸堿添加比例并使用磁力攪拌棒進(jìn)行充分混合。如表1所示，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的VIA和VIN樣品的HMW水平分別為1.3%和2.4%，遠(yuǎn)低于放大生產(chǎn)的HMW含量，因此VIN過(guò)程中顯著的聚體形成與規(guī)模有關(guān)。由于放大規(guī)模中 SUM-100 Mixer使用頂部安裝的葉輪，兩個(gè)規(guī)模混合條件的差異可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品聚集差異。為了測(cè)試這一點(diǎn)，酸滴定過(guò)程進(jìn)行攪拌與不攪拌對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩組實(shí)驗(yàn)VIA和VIN樣品的HMW水平分別從1.3%增加到3.5%和2.4%增加到13.0%。為了從機(jī)理上理解導(dǎo)致產(chǎn)物聚集的關(guān)鍵因素，我們進(jìn)一步研究了IgG4-N1在相關(guān)溶液條件下的分子特性。
pH的影響：
在pH 3.0-3.8之間研究了VIA的pH值對(duì)IgG4-N1聚集的影響，對(duì)pH值為5.5的VIN樣品進(jìn)行測(cè)試，以評(píng)估IgG4-N1暴露于各種VIA pH條件后的聚集行為。pH5.5 VIN樣品的聚體水平通常在VIN pH值調(diào)節(jié)后約20小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定（如下所述），因此，在進(jìn)行SEC測(cè)定前，將樣品儲(chǔ)存一夜。在較低的VIA pH值（圖1a）下，VIN樣品的HMW水平從1.6%（pH3.8）非線性增加到約70%（pH值為3.0），表明較低的pH值會(huì)顯著導(dǎo)致IgG4-N1聚集。
Hold time的影響：
在評(píng)估HMW水平之前，將IgG4-N1 PAE樣品調(diào)節(jié)至pH 3.3，在室溫下放置不同時(shí)間（從20分鐘到24小時(shí)）。如圖1c所示，當(dāng)直接測(cè)定VIA樣品SEC而不進(jìn)行pH回調(diào)時(shí)，SEC色譜圖上觀察到明顯的前肩峰，并且肩峰的大小隨VIA放置時(shí)間延長(zhǎng)成比例增加。SEC-MALS數(shù)據(jù)（圖1e，f）表明，對(duì)應(yīng)于前肩峰組分與天然單體具有相同的分子量，因此可能是具有較大流體動(dòng)力學(xué)半徑的部分未折疊組分。為了研究VIN放置時(shí)間的影響，在SEC檢測(cè)前，將放置3小時(shí)的VIA樣品中和至pH 5.5，并在室溫下放置不同時(shí)間（從10分鐘到24小時(shí)）。在圖1d中，在pH 3.3下觀察到的前肩峰隨著VIN放置時(shí)間增加而減少，并在24小時(shí)后最終消失，同時(shí)伴隨著高分子量聚集物的增加。
pH、Hold time以及蛋白濃度的交互影響：
使用JMP®軟件設(shè)計(jì)的全析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)評(píng)估了通過(guò)pH、放置時(shí)間和IgG4-N1聚集的蛋白質(zhì)濃度之間的相互作用。為了有助于此評(píng)估，通過(guò)使用單體衰減指數(shù)方程（方程1：）擬合動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的單體分?jǐn)?shù)來(lái)獲得聚集速率常數(shù)（k值）。如圖2a所示，由于蛋白質(zhì)濃度對(duì)IgG4-N1聚集的影響在較低pH下更為明顯，因此較低的蛋白質(zhì)濃度產(chǎn)生較低的聚集電位。圖2b和2c中的曲線分別顯示了pH為5.5 VIN的樣品的相對(duì)聚集和單體含量，這些樣品最初在30.0 g/L的蛋白質(zhì)濃度下經(jīng)受過(guò)較低的pH（3.0-3.6）。圖2d中的等高線圖總結(jié)了符合方程1的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，隨著pH的降低，k以非線性方式增加（在pH約為3.3時(shí)觀察到拐點(diǎn)），并隨著蛋白質(zhì)濃度進(jìn)一步增加。根據(jù)擬合曲線計(jì)算出的單體和高分子量值與此條件下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常一致，因此，模型擬合的k值可用于比較不同VI條件，并提供了聚集傾向的定量評(píng)估，而無(wú)需對(duì)每個(gè)單獨(dú)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。例如，在圖2e和2f中，“5分鐘時(shí)HMW%”和“穩(wěn)定期HMW%”的等高線圖表明，由于產(chǎn)品聚集動(dòng)力學(xué)強(qiáng)烈依賴(lài)于pH，VIA放置時(shí)間對(duì)VIN樣品中的HMW水平有顯著影響。
表2 IgG4-N1在不同pH條件下的Tm值
圖3 IgG4-N1在不同放置時(shí)間下的VIA和VIN樣品的熒光強(qiáng)度。（a）在pH 3.3下放置不同時(shí)間（10分鐘-3小時(shí)）的VIA樣品（b）VIA在pH 3.3放置1小時(shí)，VIN樣品在pH 5.5下放置不同時(shí)間（0分鐘 - 48小時(shí)）。
圖4 不同放置時(shí)間的VIA和VIN樣品的在線熒光SEC數(shù)據(jù)。（a）在pH 3.3下不同放置時(shí)間（10分鐘-3小時(shí)）的VIA樣品在線熒光掃描結(jié)果。垂直虛線對(duì)應(yīng)8.25分鐘的放置時(shí)間。（b）a中相同樣品的UV 280 nm信號(hào)疊加。(c) VIN樣品在pH 5.5下不同放置時(shí)間（10分鐘24小時(shí)）的熒光掃描（ VIA樣品在pH 3.3放置1小時(shí)）。（d）c中相同樣品的UV 280 nm信號(hào)疊加。
圖5 不同pH條件下VIA樣品的KD值
3.4表面電荷
如圖5a所示，隨著pH的降低，凈電荷如預(yù)期般增加，而總電荷減少。如前所述，較低pH下的凈電荷和總電荷有助于排斥靜電相互作用，阻礙單體締合和相對(duì)良好的膠體穩(wěn)定性。然而，分子內(nèi)排斥不可避免地影響維持蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的靜電、范德華力和氫鍵力的平衡，這解釋了在較低pH下構(gòu)象穩(wěn)定性較低的原因。
圖6 IgG4-N1在不同pH條件下的電荷特性（a）pH 3.0-7.0時(shí)的凈電荷和總電荷，以及相應(yīng)的表面電荷分布，其中正電荷、負(fù)電荷和中性電荷分別用藍(lán)色、紅色和白色表示。（b）pH 4.5、3.6和3.3時(shí)的表面電荷分布，其中pH 4.5（CH2）時(shí)帶負(fù)電荷的團(tuán)簇以黃色和紅色圈出。
3.5緩沖組分以及賦形劑對(duì)聚集的影響
圖7 緩沖液組分和賦形劑對(duì)酸誘導(dǎo)IgG4-N1聚集速率常數(shù)k值的影響。
3.6 CFD建模來(lái)解決低pH VI操作的放大挑戰(zhàn)
表3 SUM-100和SUM-50兩種Mixer中的VI操作參數(shù)及表現(xiàn)
圖8 采用CFD模擬SUM運(yùn)行混合條件。(a) SUM-100型在非優(yōu)化混合條件下運(yùn)行1。（b）SUM-100型在優(yōu)化混合條件下運(yùn)行2。（c）SUM-50在優(yōu)化混合條件下運(yùn)行3。(d) 三次運(yùn)行的積分低pH區(qū)（m3 s）作為時(shí)間的函數(shù)，以秒（s）為單位。（a）、（b）和（c）中的局部低pH區(qū)域（≤pH 3.3）用紅色表示。
4、結(jié)論
4.1 IgG4-N1的低pH VI過(guò)程中形成聚體的影響因素
混合條件較差會(huì)導(dǎo)致VIA過(guò)程中形成低pH區(qū)，并在VIN過(guò)程導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)物聚集。IgG4-N1的聚集傾向在pH 3.0–3.3時(shí)比在pH 3.6–8.5時(shí)要快得多。
在pH 3.3–3.6之間，觀察到聚集速率常數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)濃度（7.5–30 g/L）的弱依賴(lài)性，在pH值3.0–3.3之間觀察到更強(qiáng)的依賴(lài)性。
4.2 IgG4-N1的低pH VI過(guò)程中分子行為的描述
在VIA步驟中，低pH條件促進(jìn)強(qiáng)烈的分子內(nèi)排斥，導(dǎo)致以表面疏水性增加為特征的部分單體去折疊。這些未折疊的組分比天然單體略大，在SEC色譜圖中出現(xiàn)在單體峰的前肩。另一方面，這些單體的強(qiáng)電荷排斥促進(jìn)了膠體穩(wěn)定性并防止聚集體形成。
在VIN滴定和放置期間，蛋白質(zhì)上的排斥電荷在相對(duì)中性的pH環(huán)境下減少，降低膠體穩(wěn)定性，并通過(guò)分子間相互作用導(dǎo)致了產(chǎn)物聚集。同時(shí)，分子內(nèi)相互作用使得未折疊的單體逐漸變?yōu)楸砻媸杷越档偷奶烊徽郫B結(jié)構(gòu)。構(gòu)象改變的單體的復(fù)性是與聚集的發(fā)生是相互競(jìng)爭(zhēng)的，這取決于溶液條件和這兩個(gè)途徑之間的相對(duì)能量有利性。
4.3 實(shí)際應(yīng)用
IgG4-N1聚集主要?dú)w因于酸滴定過(guò)程中的非均相混合條件，使用小規(guī)模的混合設(shè)備時(shí)該影響通常是微不足道的，但當(dāng)使用大規(guī)模的系統(tǒng)時(shí)需要額外的注意。另外改善緩沖組分或添加賦形劑可適當(dāng)減小聚集傾向。
文獻(xiàn)來(lái)源：[1]. Weixin Jin, Zizhuo Xing, Yuanli Song, Chao Huang, Xuankuo Xu, Sanchayita Ghose & Zheng Jian Li (2019) Protein aggregation and mitigation strategy in low pH viral inactivation for monoclonal antibody purification, mAbs, 11:8, 1479-1491, DOI: 10.1080/19420862.2019.1658493
