隨著上游細(xì)胞培養(yǎng)密度和表達(dá)量的增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞碎片和亞微米膠體比例隨之增加，因此給培養(yǎng)液的澄清帶來了新的挑戰(zhàn)。本文主要研究了Mab1細(xì)胞培養(yǎng)液不同澄清方法的比較。方法包括離心后深度過濾、直接深度過濾及預(yù)處理后深層過濾。得到的結(jié)果表明預(yù)處理的使用顯著提高了深層過濾的澄清效率。其中陽離子聚合物I絮凝劑預(yù)處理后減少了5倍深層過濾膜面積，HCD殘留也降低了5-6倍，同時IgG的回收率也是可接受的(約98%)。使用同樣的預(yù)處理方式對細(xì)胞培養(yǎng)密度更高的Mab2和細(xì)胞培養(yǎng)密度更低的Mab3兩種細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行同樣方式的預(yù)處理，結(jié)果載量與HCD殘留方面表現(xiàn)相同。但是預(yù)處理劑在提高澄清效率的同時也會給終產(chǎn)品中預(yù)處理劑的去除、前期預(yù)處理工藝的開發(fā)帶來挑戰(zhàn)，因此需要從工藝開發(fā)時間成本、綜合經(jīng)濟(jì)成本、下游純化對預(yù)處理劑的清除效率、培養(yǎng)液澄清效率等多因素綜合考慮。
本文對Mab1發(fā)酵液的不同澄清方式進(jìn)行了研究（見圖1），主要包括3種策略，策略1為離心后深層過濾，深層過濾使用的濾器為兩個不同廠家的次級深層濾器，策略2為預(yù)處理后進(jìn)行深層過濾，預(yù)處理方式包括低pH調(diào)節(jié)、磷酸鈣處理、陽離子聚合物I處理、陽離子聚合物II處理4種方式，深層過濾使用的濾器為兩個不同廠家的初級深層濾器和1種復(fù)合深層濾器，策略3為初級深層過濾后進(jìn)行次級深層過濾，同樣比較了兩個不同廠家的深層濾器。結(jié)果表明陽離子聚合物I后使用復(fù)合深層濾芯的方式能夠顯著提高澄清效率。
策略2中的預(yù)處理方式包括4種，第1種方式是向發(fā)酵液中加入酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液至不同的低pH，第2種方式是向發(fā)酵液中加入不同濃度的磷酸鈣，第3種方式是向發(fā)酵液中加入不同濃度的陽離子聚合物I，第4種方式是向發(fā)酵液中加入不同濃度的陽離子聚合物II。
首先對發(fā)酵液進(jìn)行不同方式的預(yù)處理，通過濁度、收率、HCP、HCD去除等結(jié)果來篩選pH和添加物的濃度，結(jié)果見圖2。
濁度方面，所有的預(yù)處理方式都降低了濁度。當(dāng)用低pH處理時pH越低濁度越低。當(dāng)用磷酸鈣和陽離子聚合物處理時，隨著磷酸鈣和陽離子聚合物濃度的增加濁度同樣降低。收率方面，低濃度的陽離子聚合物II和pH大于4.5時收率都較高，磷酸鈣處理后收率總體偏低，陽離子聚合物I處理后在收率方面沒有明顯損失。HCP去除方面，4種預(yù)處理方式的HCP去除效率都在0.4 log以內(nèi)，正低pH條件下，pH 4.5和pH 5的HCP去除效率最高，磷酸鈣濃度越低HCP去除越多，陽離子聚合物I和陽離子聚合物II的HCP去除效率都在0.1-0.2 log范圍內(nèi)。HCD去除方面，相比于HCP，4種預(yù)處理方式對HCD去除效果明顯。在低pH條件下，pH越低HCD去除效果越好，隨著磷酸鈣濃度的增加HCD去除效率增加，當(dāng)陽離子聚合物I的濃度大于0.037%時HCD去除效率顯著增加，同時陽離子聚合物I對HCD的去除要整體好于陽離子聚合物II。
所以選擇pH 4.5乙酸、75 mm磷酸鈣、0.037%陽離子聚合物I、0.037%陽離子聚合物II作為4種預(yù)處理條件進(jìn)行后續(xù)研究。
使用上述4種預(yù)處理方式對Mab1的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，考察處理后樣品中的顆粒大小和粒徑分布（見圖3和表1）。陽離子聚合物I處理后的樣品粒徑最大，然后依次是陽離子聚合物II、磷酸鈣、pH4.5乙酸處理后的樣品。其中磷酸鈣處理后的樣品粒徑分布最寬。進(jìn)行粒徑大小和粒徑分布范圍的研究目的是選擇1個合適的深層濾器，由于經(jīng)過這4種預(yù)處理后的樣品中粒徑分布基本在20-30 um之間，所以選擇的深層濾器為0.5-20 um的復(fù)合深層濾器。
在選擇了這個復(fù)合深層濾器后接著考察了濾器的過濾表現(xiàn)（見圖4）。Mab1的發(fā)酵液經(jīng)過4種預(yù)處理后使用這個0.5-20 um的復(fù)合深層濾器過濾，未經(jīng)預(yù)處理的發(fā)酵液直接使用初級深層濾器過濾，結(jié)果壓力迅速上升，壓力表現(xiàn)最差。同樣未經(jīng)預(yù)處理的發(fā)酵液直接使用0.5-20 um復(fù)合深層濾器過濾，壓力表現(xiàn)有所改善。而經(jīng)過4種預(yù)處理后進(jìn)行復(fù)合深層過濾的壓力表現(xiàn)均比未經(jīng)過預(yù)處理直接進(jìn)行過濾的壓力表現(xiàn)要好，其中陽離子聚合物I處理后進(jìn)行復(fù)合深層過濾的壓力表現(xiàn)最好。
接著考察了Mab1發(fā)酵液在策略2中各種澄清方式的澄清效果，分別從處理后樣品的濁度、濾器的容污能力、濾器載量、收率、HCP去除、HCD去除幾個方面考察（見圖5和圖6）。
可以看到，在使用傳統(tǒng)的初級深層濾器過濾時，經(jīng)過預(yù)處理的樣品深層過濾后的濁度更好，但是濾器載量和容污能力不佳。在使用復(fù)合深層濾器時，經(jīng)過預(yù)處理的樣品比不經(jīng)過預(yù)處理的樣品無論是濁度、濾器的載量和容污能力都要好，其中陽離子聚合物I的整體表現(xiàn)最好，濁度為23NTU、容污能力為91，而載量為450 L/m2，這明顯高于其他澄清方式。而在同樣使用預(yù)處理的條件下，復(fù)合濾器比初級濾器的這些表現(xiàn)都要好。在收率方面，使用75 mm磷酸鈣、pH4.5乙酸、0.037%陽離子聚合物II預(yù)處理后進(jìn)行復(fù)合濾芯深層過濾，收率相對偏低，分別為80%、91%、92%，而使用0.037%陽離子聚合物I預(yù)處理后進(jìn)行復(fù)合濾芯深層過濾的收率在97%以上。在HCP去除方面，各種方式的HCP去除效果沒有明顯區(qū)別，都在0.3 log以下，都不顯著。在HCD去除方面，0.037%陽離子聚合物I預(yù)處理后復(fù)合深層過濾明顯優(yōu)于其他方式，HCD的去除接近5 log。因此在策略2中的各種發(fā)酵液澄清方式中，使用陽離子聚合物I預(yù)處理后經(jīng)過復(fù)合深層濾芯過濾在HCD去除、收率、載量、濁度方面表現(xiàn)最好。
對3種策略的澄清效果進(jìn)行整體比較，結(jié)果見圖7。策略1與策略3相比，也就是離心后進(jìn)行初級深層過濾與初級深層過濾后進(jìn)行次級深層過濾相比，在收率、載量、HCP去除、HCD去除方面均無顯著差異。而策略2種的0.037%陽離子聚合物I預(yù)處理加復(fù)合深層過濾的方式表現(xiàn)最好，收率和HCP去除與策略1和策略3相當(dāng)，而載量提高了5-6倍，HCD的去除率也提高到5倍以上。
最后用另外兩種抗體發(fā)酵液Mab2和Mab3對陽離子聚合物I加復(fù)合深層濾芯的澄清效率進(jìn)行驗(yàn)證，Mab1、Mab2、Mab3代表3種不同細(xì)胞密度和表達(dá)量的發(fā)酵液，結(jié)果見表2和圖8。在Mab1的實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，載量提高了約5倍，在Mab2和Mab3的實(shí)驗(yàn)中載量提高了約2倍。3種抗體的HCP去除都在0.1-0.2 log范圍內(nèi)，不顯著并且無明顯區(qū)別。而在HCD的去除中，Mab1和Mab2都在5-6 log范圍內(nèi)，Mab3則在2 log，這可能是由于Mab3的細(xì)胞培養(yǎng)密度低導(dǎo)致。
這種陽離子聚合物I預(yù)處理后進(jìn)行復(fù)合深層過濾的澄清方式能夠明顯提高載量、對于HCD的去除有顯著的提高、對于收率和濁度也有改善，在降低膜面積的同時提高了澄清效率，這顯然是一種好的澄清方式。然而，在最終確定最佳澄清方法時，必須綜合考慮所需的工藝開發(fā)時間、資金成本、消耗性成本、預(yù)處理化學(xué)品的成本、驗(yàn)證處理劑清除率的測試成本、易于規(guī)?；榷喾矫嬉蛩?。
參考文獻(xiàn)：
Sandeep R. Hadpe1, Vipin Mohite1, Solomon Alva1, Anurag S. Rathore Pretreatments for enhancing clarification efficiency of depth filtration during production of monoclonal antibody therapeutics[J]. Biotechnology Progress, 2020; 36:https://doi.org/10.1002/btpr.2996
