抗體偶聯(lián)藥物（ADC）由單克隆抗體通過(guò)連接子（linker）與小分子細(xì)胞毒素偶聯(lián)形成。其中抗體可以特異性地與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用使ADC藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，隨后小分子細(xì)胞毒素在胞內(nèi)釋放并殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療作用。

每個(gè)抗體連接的小分子細(xì)胞毒素的平均值為藥物抗體偶聯(lián)比（Drug-to-antibody ratio, DAR），DAR值是ADC藥物最重要的質(zhì)量屬性之一。低的DAR值會(huì)降低ADC藥物的效力，高的DAR值又會(huì)影響ADC分析的藥代動(dòng)力學(xué)和毒性，所以對(duì)ADC藥物進(jìn)行DAR分析尤為重要^[1]。ADC藥物的DAR值會(huì)受不同偶聯(lián)方式的影響，常見(jiàn)的偶聯(lián)方式有半胱氨酸偶聯(lián)、賴氨酸偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)，常用的DAR值分析方法有紫外可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）、反相色譜法（RP）、疏水作用色譜法（HIC）和質(zhì)譜法（LC-MS）等。

1、紫外可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）

ADC藥物的裸抗和小分子毒素最大吸收波長(zhǎng)不同，紫外可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）可通過(guò)分別檢測(cè)裸抗和小分子藥物最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度, 根據(jù)各自的消光系數(shù)計(jì)算摩爾濃度，進(jìn)而得到DAR值。

疏水作用色譜法（HIC）是根據(jù)ADC藥物的疏水性進(jìn)行分離。通過(guò)梯度變化降低流動(dòng)相鹽濃度，按照疏水性由低到高的順序逐漸洗脫，藥物連接的小分子毒素越多，疏水性越強(qiáng)，在色譜柱的保留時(shí)間越長(zhǎng)。HIC法洗脫條件溫和，可保持分子的天然狀態(tài)，較適用于半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物。通過(guò)半胱氨酸偶聯(lián)可產(chǎn)生含有0-8個(gè)小分子毒素的DAR值種類，二硫鍵還原后可產(chǎn)生2個(gè)游離巰基，所以連接的小分子一般以偶數(shù)出現(xiàn)。HIC法不僅可以基于其疏水差異有效分離不同小分子數(shù)目的藥物計(jì)算DAR值，還可以得到不同偶聯(lián)個(gè)數(shù)的藥物分布，計(jì)算平均DAR值。由于HIC法可以在天然條件下分離DAR種類，可以應(yīng)用于樣品純化。雖然HIC法非常適用于ADC藥物分析，但也有一定的缺陷，由于流動(dòng)相為非揮發(fā)性鹽而對(duì)質(zhì)譜不兼容。

反相色譜法（RP）與HIC法分離原理相同，都是基于ADC藥物的疏水性差異實(shí)現(xiàn)不同組分的分離。但反相色譜流動(dòng)相中存在有機(jī)溶劑，使蛋白質(zhì)變性，破壞二硫鍵。因此，采用反相色譜法，常在樣品分析前用巰基乙醇充分還原，對(duì)攜帶不同數(shù)目小分子藥物的LC和HC進(jìn)行分離，也可用于天然ADC分離L、H、HH、HL和HHL片段，計(jì)算平均DAR值。因流動(dòng)相中不含非揮發(fā)性鹽，可通過(guò)質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行鑒定，計(jì)算帶有不同數(shù)目藥物的輕重鏈比例，對(duì)于基于半胱氨酸偶聯(lián)ADC的DAR及藥物分布分析具有重要的借鑒意義。

質(zhì)譜法可分為變性質(zhì)譜法和天然質(zhì)譜法，兩種方法都是基于藥物的分子量差異進(jìn)行DAR值分析。質(zhì)譜法適用于各種偶聯(lián)方式的ADC藥物，分析前通常需要額外的樣品前處理以減少質(zhì)譜的復(fù)雜度，常采用PNGase F酶去除ADC藥物的N-糖糖基化和CpB酶去除C末端賴氨酸。質(zhì)譜法可檢測(cè)完整ADC分子，直接反應(yīng)ADC藥物的連接情況，通過(guò)各個(gè)峰面積百分比和各自攜帶小分子藥物的數(shù)量得到加權(quán)平均DAR值。也可加入還原劑得到不同數(shù)目藥物的重輕鏈的比例和DAR值。

賦成生物擁有自己的ADC偶聯(lián)技術(shù)平臺(tái)和與技術(shù)路線相對(duì)應(yīng)的分析方法開(kāi)發(fā)和質(zhì)控平臺(tái)，可針對(duì)ADC藥物的不同偶聯(lián)方式、不同的Linker和Payload，為客戶提供定制化的DAR值檢測(cè)和開(kāi)發(fā)服務(wù)，下面為MMAE偶聯(lián)ADC藥物的開(kāi)發(fā)實(shí)例▼

? 賦成生物承接的客戶ADC項(xiàng)目，通過(guò)賦成生物偶聯(lián)技術(shù)平臺(tái)（半胱氨酸偶聯(lián)方式）偶聯(lián)小分子MMAE，并采用疏水作用色譜HIC法對(duì)具有相同Linker和Payload的市售ADC藥物和賦成生物偶聯(lián)ADC藥物進(jìn)行DAR檢測(cè)，結(jié)果圖譜和表明：與市售ADC藥物相比，賦成生物偶聯(lián)的ADC藥物DAR4比例顯著提高，藥物分布更具有均一性。

參考文獻(xiàn)

[1] 于傳飛, 王文波, 武鋼.一種基于半胱氨酸偶聯(lián)的抗體偶聯(lián)藥物的藥物抗體偶聯(lián)比測(cè)定[J]. Chinese journal of New Drugs. 2015, 24(20): 2336-2340

[2] Yutaka Matsuda, Brian A. Mendelsohn. Recent Advances in Drug–Antibody Ratio Determination of Antibody–Drug Conjugates[J]. Chem. Pharm. Bull. 2021, 69(10): 976-983